劉瑜 李丕武

1 葡萄糖氧化酶簡(jiǎn)介

葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）最早在黑曲霉的提取物中發(fā)現(xiàn)［1］，系統(tǒng)名稱為β-D-葡萄糖：氧1-氧化還原酶（EC 1.1.3.4）。它能夠催化β-D-葡萄糖被氧氣氧化成葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯，并生成過(guò)氧化氫［2］。生成的葡萄糖 -δ-內(nèi)酯隨后自發(fā)水解［2］或者在內(nèi)酯酶的作用下水解成葡萄糖酸［3］。相關(guān)反應(yīng)，如圖1所示。

圖1 葡萄糖氧化酶酶促反應(yīng)［4］

GOD應(yīng)用廣泛，可用于葡萄糖傳感器制造［5］、面粉添加劑［6］、葡萄糖酸及其鹽生產(chǎn)［7］和生物燃料電池［8］等領(lǐng)域。因此，尋求更有效的GOD的生產(chǎn)方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前生產(chǎn)GOD的微生物有黑曲霉（Aspergillus niger）［9］、尼琦青霉（Penicillium amagasakiense）［10］、變幻青霉（Penicillium variabile）［11］和軟毛青霉（Penicillium puberulum）［12］等，其中以黑曲霉最為重要。

2 黑曲霉GOD結(jié)構(gòu)性質(zhì)簡(jiǎn)介

黑曲霉GOD含有兩個(gè)相同的亞基，兩個(gè)亞基通過(guò)兩個(gè)二硫鍵相結(jié)合［13］，每個(gè)亞基含有一個(gè)緊密非共價(jià)結(jié)合的 FAD 分子［14］。Swoboda 和 Massey［15］測(cè)得相對(duì)分子質(zhì)量為18.6kD，熱變性或化學(xué)變性（8mol/L尿素）后測(cè)出每分子含有1個(gè)巰基和兩個(gè)二硫鍵，酶分子糖含量為16.5％（±0.8％），如此高的糖含量使得黑曲霉GOD具有很多不尋常的性質(zhì)：100℃時(shí)不發(fā)生沉淀；對(duì)0.75％的十二烷基硫酸鈉（SDS）穩(wěn)定；5％的三氯乙酸只能使其緩慢沉淀；在水中的溶解度較高，需要較高濃度的鹽才能沉淀（80％-90％ 硫酸銨）。Nakamura和 Fujiki［16］測(cè)定其含有的糖主要是甘露糖、葡萄糖和己糖胺。Kalisz等［17］測(cè)得最適pH5.5-6.0，且糖鏈對(duì)酶的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和活力不起主要作用。1989年，Kriechbaum等［18］首先克隆了黑曲霉NRRL-3的GOD基因，該基因由1 815個(gè)堿基對(duì)組成，編碼一個(gè)亞基的605個(gè)氨基酸殘基。由于成熟的酶的一個(gè)亞基含有584個(gè)氨基酸殘基，因此確定有21個(gè)氨基酸殘基組成了信號(hào)序列。1993年，Hecht等［19］得到了分辨率為2.3 ?的部分脫糖基的黑曲霉GOD晶體結(jié)構(gòu)模型。1999年，Wohlfahrt等［20］獲得了黑曲霉GOD1.9?的結(jié)構(gòu)，從結(jié)構(gòu)上解釋了酶對(duì)底物的專一性、D-葡萄烯糖的競(jìng)爭(zhēng)性抑制、鹵素離子的抑制作用等性質(zhì)。2011年，Kommoju等［21］得到了該酶分辨率為1.2?的結(jié)構(gòu)，并以氯離子代替氧探索了氧激活位點(diǎn)。

3 黑曲霉GOD生產(chǎn)進(jìn)展

3.1 黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)GOD

黑曲霉發(fā)酵是傳統(tǒng)的GOD生產(chǎn)方法，也是目前為止被研究得最多的方法。近年來(lái)研究成果主要有：Liu等［22］利用臺(tái)式生物反應(yīng)器對(duì)黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)GOD進(jìn)行了響應(yīng)面優(yōu)化，并對(duì)菌絲體生長(zhǎng)、GOD的生產(chǎn)和葡萄糖的消耗進(jìn)行了模擬，得到的模擬結(jié)果能夠較好地與試驗(yàn)結(jié)果吻合。 Mirón等［23］研究了碳源和氮源對(duì)黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)GOD的共同作用，著重針對(duì)于NP2和N2P交互作用進(jìn)行了因素試驗(yàn)，結(jié)果表明無(wú)機(jī)氮源（硝基氮）比有機(jī)氮源（蛋白胨）更適合產(chǎn)酶，有機(jī)氮源能夠促進(jìn)菌體生長(zhǎng)而不利于葡萄糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖酸；確定了最佳碳源和氮源比例，使酶活從1.8U/mL提高到12U/mL。Gera等［24］研究了葡萄糖、蔗糖和棉子糖對(duì)黑曲霉NRRL326產(chǎn)酶的影響，表明蔗糖效果最好（4.5U/mL），但當(dāng)濃度大于20g/L時(shí)對(duì)產(chǎn)酶有明顯的抑制作用。Bankar等［25］分兩步對(duì)產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定碳酸鈣、蛋白胨和硫酸鎂為顯著因素，并使酶活力從0.009 93U/mL提高到了2.05U/mL，培養(yǎng)時(shí)間從96h降低到72h。Khattab和Bazaraa［26］采用先誘變后原生質(zhì)體融合的方法以黑曲霉FS-3（發(fā)酵液酶活力15.9U/mL）為出發(fā)菌株篩選高產(chǎn)菌株，得到了融合子C-18，胞外酶活力達(dá)62.7U/mL。

從以上資料可以看出，目前的研究集中于新菌株的篩選以及方法的優(yōu)化，并獲得發(fā)酵過(guò)程中的動(dòng)力學(xué)模型。由于黑曲霉產(chǎn)酶不高，且大部分的酶存在于細(xì)胞壁和胞內(nèi)［27］；分離純化困難，而且該方法經(jīng)過(guò)多年的研究，產(chǎn)量提高的潛力相當(dāng)有限，因此需要利用新的方法提高GOD的產(chǎn)量。

3.2 基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)GOD

利用基因工程的方法解決黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)酶不高的問(wèn)題，策略有兩種：第一是通過(guò)增加黑曲霉中的GOD基因的拷貝數(shù)來(lái)增加產(chǎn)量；第二是對(duì)GOD基因進(jìn)行異源表達(dá)，使基因擺脫原來(lái)調(diào)控系統(tǒng)的限制，在人為構(gòu)建的表達(dá)盒中得到高效的表達(dá)。

3.2.1 黑曲霉基因工程菌的構(gòu)建與發(fā)酵 絲狀真菌被用來(lái)表達(dá)內(nèi)源和外源蛋白具有以下優(yōu)勢(shì)：真菌能夠大量的分泌蛋白，可以避免蛋白在細(xì)胞內(nèi)積聚可能會(huì)對(duì)細(xì)胞造成毒害的問(wèn)題。并且，由于其發(fā)酵技術(shù)較為成熟，絲狀真菌可以在廉價(jià)的培養(yǎng)基中大量的生長(zhǎng)，在優(yōu)化的生長(zhǎng)條件下，自身蛋白能達(dá)到較高的分泌水平；另外，作為一種真核生物，其所具有的翻譯后加工機(jī)制在生產(chǎn)需要復(fù)雜翻譯后修飾的蛋白方面具有額外的優(yōu)勢(shì)。最后，很多重要的工業(yè)絲狀真菌如黑曲霉、米曲霉、里氏木霉、頂頭孢霉和產(chǎn)黃青霉本身為GRAS微生物，在生產(chǎn)藥用蛋白和食品用蛋白時(shí)具有良好的生物安全性［28］。

目前，在產(chǎn)GOD黑曲霉基因工程菌構(gòu)建方面已經(jīng)完成的主要工作如表1所示。

表1 已報(bào)道的產(chǎn)GOD基因工程黑曲霉的構(gòu)建

人們還對(duì)黑曲霉工程菌的培養(yǎng)做了很多研究工作。 El-Enshas等［32］研 究 了 NRRL-3（GOD3-18）在搖瓶和攪拌罐式反應(yīng)器培養(yǎng)時(shí)菌絲形態(tài)及其與GOD分泌之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，小而致密的菌絲球有利于GOD的分泌，推測(cè)原因是小的菌絲球有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳遞。搖瓶培養(yǎng)時(shí)形成的菌絲球明顯分層并中空，而攪拌罐式反應(yīng)器中菌絲球的形成分為兩步。隨后他又研究了非葡萄糖碳源對(duì)NRRL-3（GOD3-18）中GpdA啟動(dòng)子控制下GOD生產(chǎn)的影響，指出在碳源為葡萄糖、果糖和木糖時(shí)，GpdA啟動(dòng)子控制下的GOD的合成同細(xì)胞生長(zhǎng)嚴(yán)格耦聯(lián)；在5 L攪拌罐式反應(yīng)器發(fā)酵120h后，木糖作為碳源時(shí)GOD總活力、比活力和胞外比例分別為626.0 μKat/L、42.0 μKat/CDW（CDW：細(xì)胞干重）和87.0％，優(yōu)于或接近使用葡萄糖為碳源的水平（234.0 μKat/L、48.0 μKat/CDW和89.0％），并且不形成葡萄糖酸［33］。

提高黑曲霉GOD基因的劑量能夠使GOD表達(dá)水平相對(duì)出發(fā)菌株有較大提高，但是最終效果同傳統(tǒng)菌種改造方法差別不大，對(duì)于工業(yè)應(yīng)用缺乏足夠吸引力。其可能原因是絲狀真菌表達(dá)系統(tǒng)不夠成熟，需要絲狀真菌遺傳學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)理論的發(fā)展。

3.2.2 釀酒酵母表達(dá)黑曲霉GOD 釀酒酵母是應(yīng)用最早的真核表達(dá)系統(tǒng)，其具有的一些特點(diǎn)使其成為表達(dá)工業(yè)和醫(yī)學(xué)所用外源蛋白的重要工具。首先，作為一種公認(rèn)安全的微生物，將其用于藥物蛋白的生產(chǎn)已為人們所高度接受。相比之下，大腸桿菌表達(dá)的外源蛋白可能會(huì)含有內(nèi)毒素，哺乳動(dòng)物細(xì)胞可能會(huì)含有致瘤或病毒DNA。其次，釀酒酵母可以在簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基上快速的生長(zhǎng)，并達(dá)到很高的細(xì)胞密度。最后，其遺傳學(xué)特性比其他任何真核生物的研究都更加透徹，可以像大腸桿菌一樣方便的進(jìn)行操作。釀酒酵母是第一種用于黑曲霉GOD外源表達(dá)的微生物，早在1990年，F(xiàn)rederick等［34］首先用釀酒酵母GRF181表達(dá)了黑曲霉GOD基因。已發(fā)表的以釀酒酵母為黑曲霉GOD表達(dá)宿主的主要文獻(xiàn)列于表2。

表2 釀酒酵母表達(dá)黑曲霉葡萄糖氧化酶的研究概況

為了提高酶的產(chǎn)量，很多學(xué)者對(duì)釀酒酵母基因工程菌的培養(yǎng)進(jìn)行了詳細(xì)研究。從1998年-2001年，Kapat等［41-44］連續(xù)發(fā)表了4篇論文探討產(chǎn)黑曲霉GOD基因工程釀酒酵母培養(yǎng)的問(wèn)題。在首先發(fā)表的論文中研究了不同的補(bǔ)糖（包括葡萄糖和半乳糖）策略對(duì)重組釀酒酵母產(chǎn)GOD的影響，恒速流加半乳糖的策略下產(chǎn)酶達(dá)到最高，達(dá)154U/mL，比分批式操作提高了52％［41］。之后運(yùn)用恒定pH反饋補(bǔ)料分批式發(fā)酵策略使胞外酶活力提高到了199U/mL，比普通分批式發(fā)酵提高了1倍多，比非反饋控制的補(bǔ)料分批式發(fā)酵（154U/mL）提高了28％［44］。隨后他們的試驗(yàn)證實(shí)了連續(xù)補(bǔ)加半乳糖不適合重組黑曲霉GOD發(fā)酵：雖然96h后酶活力達(dá)到164U/mL，但是會(huì)形成過(guò)量的乙醇，并且還會(huì)造成表達(dá)載體的不穩(wěn)定［43］。2001年發(fā)表的論文中，他們雖然證明了攪拌速率對(duì)酶產(chǎn)量有直接的作用，但是建立kLa與酶產(chǎn)量之間的關(guān)系的工作沒(méi)有成功［42］。

綜合上述文獻(xiàn)，有兩點(diǎn)需要引起注意：第一，使用GOD本身的信號(hào)肽序列可以取很高的分泌水平，甚至比常用的分泌效率已經(jīng)很強(qiáng)的強(qiáng)釀酒酵母α-factor信號(hào)肽序列更高［34］；第二，不同的釀酒酵母作為表達(dá)宿主時(shí)表達(dá)水平相差很大，De Baetselier等［45］在其論文中也指出，在利用相同的表達(dá)載體表達(dá)相同的黑曲霉GOD基因時(shí)，不同的釀酒酵母菌株表達(dá)水平高者和低者可相差百倍。隨著將來(lái)對(duì)這些現(xiàn)象內(nèi)在機(jī)制的深入研究，必將使得人們對(duì)外源蛋白的表達(dá)機(jī)制的認(rèn)識(shí)得到進(jìn)一步的深化。

同其他主要表達(dá)體系相比，使用釀酒酵母進(jìn)行表達(dá)雖然是較早的方法，但是取得的效果較新興的表達(dá)體系相差并不很多［36，46，47］，其原因有待深入探討；釀酒酵母為GRAS生物，重組酶的生物安全性也較好。缺點(diǎn)在于目前大部分采用的均為附加體載體，這種載體的優(yōu)點(diǎn)是拷貝數(shù)高，但是在發(fā)酵過(guò)程中容易丟失，造成菌種生產(chǎn)性能的不穩(wěn)定。整合型載體穩(wěn)定性好，但是目前表達(dá)水平還不盡如人意。3.2.3 巴斯德畢赤酵母表達(dá)黑曲霉GOD 巴斯德畢赤酵母是一種成熟的真核微生物外源蛋白表達(dá)平臺(tái)，具有以下特點(diǎn)［48］：生長(zhǎng)迅速并培養(yǎng)廉價(jià)；作為一種真核生物，具備翻譯后蛋白加工能力，在酵母中合成的蛋白質(zhì)更有可能正確的加工、折疊與正確的組裝成具有功能的分子。同釀酒酵母和其他酵母相比，畢赤酵母不傾向于發(fā)酵糖和其他碳源，而更傾向于利用它們進(jìn)行有氧呼吸生長(zhǎng)，這極大地有利于高細(xì)胞培養(yǎng)：因?yàn)樗皇呛?jiǎn)單的把碳源轉(zhuǎn)化成生物量，不產(chǎn)生大量的有毒的發(fā)酵產(chǎn)物，如乙醇。重組蛋白的產(chǎn)量通常同生物量成比例，因此巴斯德畢赤酵母易于進(jìn)行高密度培養(yǎng)是一個(gè)主要的優(yōu)勢(shì)。另外，巴斯德畢赤酵母能夠以甲醇為唯一碳源和能源進(jìn)行生長(zhǎng)，在這種條件下，醇脫氫酶（AOX）和二羥丙酮合酶（DHAS）可以占細(xì)胞蛋白的近30％，并且這兩種蛋白的水平的調(diào)控主要是在轉(zhuǎn)錄水平上的，因此使用其啟動(dòng)子可以驅(qū)使外源基因得到較高水平的表達(dá)。近年來(lái)關(guān)于利用巴斯德畢赤酵母表達(dá)黑曲霉GOD的主要報(bào)道，如表3所示。

表3 巴斯德畢赤酵母表達(dá)黑曲霉葡萄糖氧化酶的研究概況

畢赤酵母表達(dá)黑曲霉GOD在發(fā)酵罐中可以達(dá)到很高水平［46］，但在搖瓶中表達(dá)水平不高，這是由于畢赤酵母本身的特性所致［48］。在某些情形下，重組酶的特性還有所改善，如周亞鳳［49］報(bào)道重組GOD的比活、轉(zhuǎn)換數(shù)kcat值及二級(jí)動(dòng)力學(xué)常數(shù) kcat /Km比活明顯地高于商品酶，黃亮［51］報(bào)道重組酶最適溫度較黑曲霉GOD提高了8℃。但是，巴斯德畢赤酵母為宿主表達(dá)黑曲霉GOD也還存在一些缺點(diǎn)：首先是巴斯德畢赤酵母本身不屬于美國(guó)食品藥品管理局（FDA）所認(rèn)證的GRAS微生物，表達(dá)的重組酶存在生物安全性問(wèn)題，限制了在食品方面的應(yīng)用；其次，誘導(dǎo)型表達(dá)過(guò)程中需要甲醇誘導(dǎo)，而甲醇是有毒易燃品，不但給生產(chǎn)人員的安全和消防安全帶來(lái)隱患，而且在酶的分離純化過(guò)程中帶來(lái)額外的麻煩，特別是將GOD用作食品添加劑時(shí)。組成型表達(dá)可以避免這個(gè)問(wèn)題，但是酶活力很低［52］。因此將巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用于黑曲霉GOD的工業(yè)化生產(chǎn)還存在很多問(wèn)題亟待解決。釀酒酵母和巴斯德畢赤酵母在表達(dá)黑曲霉GOD方面的比較如表4所示。3.2.4 其他表達(dá)系統(tǒng)在表達(dá)黑曲霉GOD 其他表達(dá)系統(tǒng)在黑曲霉GOD表達(dá)方面應(yīng)用的不多。安玉麟等［53］用原核生物大腸桿菌表達(dá)了黑曲霉酶GOD，得到的轉(zhuǎn)化子的總蛋白同抗黑曲霉GOD血清有較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。在真核表達(dá)方面，Whittington等［29］通過(guò)基因工程手段使不產(chǎn)GOD的構(gòu)巢曲霉顯著的表達(dá)了黑曲霉GOD。Hodgkins等［54］使用多型漢遜酵母表達(dá)了黑曲霉GOD，胞外酶活力達(dá)到445U/mL（2.25g/mL），胞內(nèi)酶活為 76U/mL（0.38g/mL），達(dá)到了很高的水平。2006年，母敬郁等［55］以瑞氏木霉為宿主進(jìn)行表達(dá)，誘導(dǎo)5d后酶活為25U/mL。2010年，Rocha［56］發(fā)表了以馬克斯克魯維酵母表達(dá)GOD的結(jié)果，當(dāng)以附加體表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)時(shí)，胞外酶活最高為 1552U/g DCW（DCW：Dry Cell Weight）。同年，Dowdells等［57］在土曲霉中表達(dá)了黑曲霉GOD，并用轉(zhuǎn)化子進(jìn)行葡萄糖糖酸的生產(chǎn)。

表4 表達(dá)黑曲霉GOD釀酒酵母和巴斯德畢赤酵母基因工程菌的比較

3.2.5 黑曲霉GOD基因的改造 定向進(jìn)化已經(jīng)成為獲得高效生物催化劑的重要手段，其主要原理是向蛋白編碼基因中引入隨機(jī)突變并利用高通量篩選手段篩選蛋白突變體，進(jìn)而選擇出其對(duì)應(yīng)的編碼序列以進(jìn)行下一步的突變與篩選，不斷的重復(fù)這一過(guò)程使得有益突變得到積累。定向進(jìn)化的過(guò)程由幾個(gè)步驟循環(huán)進(jìn)行：產(chǎn)生隨機(jī)的基因文庫(kù)；在適宜的宿主中表達(dá)；篩選突變酶的文庫(kù)，尋求具有感興趣的性質(zhì)的突變體［58］。手段有 DNA shuffling［59］，易錯(cuò)PCR［60］和交錯(cuò)延伸過(guò)程［61］等。

劉丹等［62］通過(guò)兩輪易錯(cuò)PCR，從3000多個(gè)突變子中得到3個(gè)酶活提高的突變株，成功使比活力提高到原來(lái)的3-4倍。Prodanovic等［63］采用超高通量篩選從含有105個(gè)突變體的107個(gè)細(xì)胞中得到催化活力提高2倍的突變體K150R。Yu等［64］利用定向進(jìn)化的手段得到了更適用于酶電極的突變體B11-Gox。Holland等［65］通過(guò)對(duì)黑曲霉GOD基因進(jìn)行飽和突變發(fā)現(xiàn)，當(dāng)132位的蘇氨酸突變成絲氨酸時(shí)，特異性常數(shù)kcat/Km從8.39mmol/L/S變?yōu)?3.8mmol/L/s，同時(shí)對(duì)底物親和力僅僅降低了3％。對(duì)于GOD的定向進(jìn)化還處于起步階段，發(fā)展?jié)摿艽蟆?/p>

4 展望

4.1 深入研究宿主蛋白表達(dá)分泌機(jī)制，通過(guò)基因工程手段改良現(xiàn)有表達(dá)系統(tǒng)

不同的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)黑曲霉GOD的水平的差別相當(dāng)大［31，36，47，54，55］，并且用相同的載體轉(zhuǎn)化同一種生物的不同菌株，得到的外源蛋白的表達(dá)水平也有相當(dāng)大的差別［45］，宿主細(xì)胞蛋白表達(dá)與分泌機(jī)制的不同是導(dǎo)致該結(jié)果的重要的原因。目前，一些主要的外源蛋白表達(dá)宿主均已經(jīng)完成了基因組測(cè)序［66-69］，對(duì)這些微生物的蛋白表達(dá)、加工、分泌機(jī)制的研究也在進(jìn)一步的深入。通過(guò)對(duì)微生物原有分泌表達(dá)機(jī)器的改造，可以獲得更適用于蛋白生產(chǎn)的菌株。因此，需要從基因組水平乃至蛋白質(zhì)組水平對(duì)外源蛋白分泌表達(dá)機(jī)制深入的進(jìn)行研究，并以分子生物學(xué)操作獲得更合適的宿主菌株，使現(xiàn)在發(fā)展較成熟的表達(dá)系統(tǒng)得到進(jìn)一步的發(fā)展。

4.2 開發(fā)新型表達(dá)載體與宿主

開發(fā)新型的表達(dá)載體和宿主也是解決外源蛋白表達(dá)水平不高的有效途徑。為了解決附加體載體的不穩(wěn)定性和整合型載體拷貝數(shù)少的問(wèn)題，Lopes等［70，71］開發(fā)了rDNA整合型載體，每個(gè)細(xì)胞中整合的拷貝數(shù)可達(dá)100-200個(gè)，并且具有相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性。

4.3 蛋白質(zhì)定向進(jìn)化

通過(guò)高通量篩選突變體，積累有益突變，可以得到比活力更高的酶，或者具有其他優(yōu)良特性的酶，加強(qiáng)酶的耐熱性、穩(wěn)定性等。

4.4 過(guò)程優(yōu)化

包括誘導(dǎo)劑［43］、過(guò)程條件［42］、培養(yǎng)基成分［33］等。通過(guò)這些可以增加酶產(chǎn)量，促進(jìn)酶的分泌［32］，降低工程菌自身的蛋白酶活性［72］等。另外，反應(yīng)器培養(yǎng)時(shí)表達(dá)水平有可能與搖瓶不同，因此在放大過(guò)程中也需要進(jìn)一步的優(yōu)化條件［72］。

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