張玉霞 梁瓊 雍國新

近幾年來學(xué)者們發(fā)現(xiàn)，在癌癥治療過程中導(dǎo)致治療失敗的主要原因是藥物耐藥和轉(zhuǎn)移，因此對這2個表型之間的關(guān)聯(lián)展開了廣泛的研究［1］。自20世紀80年代初Tsurno等報道鈣離子拮抗劑維拉帕米（Verapamil，異博定）能增強化療藥物對耐藥細胞的毒性以來，科學(xué)家對逆轉(zhuǎn)藥開展了廣泛深入的研究，其中對30多種不同的P-gp抑制劑做了150多個臨床試驗，沒有一種P-gp抑制劑被美國FDA批準，這些P-gp抑制劑主要缺點是毒副作用大，溶解度差、并且改變化療藥物的藥代動力學(xué)特征［2］，難以推廣應(yīng)用。因而篩選毒副作用小、逆轉(zhuǎn)作用強的逆轉(zhuǎn)藥物就成為該領(lǐng)域的熱點研究之一。

海洋生物活性物質(zhì)是抗腫瘤藥物研究中一個重要的研究領(lǐng)域。近十多年來，已從不同的海洋生物中分離到許多新型的抗腫瘤天然藥物，發(fā)現(xiàn)其可通過抑制細胞的增殖分裂或誘導(dǎo)細胞凋亡的機制發(fā)揮抗腫瘤的作用。目前已有十幾種抗腫瘤療效高、毒性低的海洋生物天然藥物或其結(jié)構(gòu)改造化合物進入臨床試驗，顯現(xiàn)出誘人的前景［3］。FAT是本實驗室首次從我國南海海域生長的一種生物組織中分離出來的抗癌活性成分，具有較強的生物活性。本試驗中選取典型多藥耐藥細胞株K562/A02作為研究對象。通過探討FAT對K562/A02細胞的多藥耐藥逆轉(zhuǎn)作用及其逆轉(zhuǎn)機制，為其進一步研究和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 K562細胞由中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所提供，K562/A02細胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院天津血液研究所提供。

1.1.2 試劑和藥物 RPMI-1640粉（美國HyClone公司）；小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品）；ADM（阿霉素）、VRP（美國Alexis產(chǎn)品）；MTT、DMSO、SDS（美國Sigma公司）；牛血清白蛋白（BSA）（BM公司，北京鼎國生物技術(shù)有限公司分裝）；Folin-酚試劑（北京鼎國生物技術(shù)有限公司）；其它試劑（國產(chǎn)分析純）。

1.1.3 主要儀器 TC2323CO2培養(yǎng)箱（美國Shellab公司）；CH2-TKC-3倒置光學(xué)顯微鏡、CH3ORF200生物顯微鏡（日本Olympus Optical公司）；CJT-12超凈工作臺（北京昌平長城空氣凈化公司）；DG-5031型酶聯(lián)免疫檢測儀（國營華東電子管廠）；UV-1601紫外分光光度儀（日本Shimadzu公司）；BP211D電子天平（德國Sartorius公司）；420A型pH計（美國ORION公司）；ZW-A型微量振蕩器（常州國華電器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 四唑鹽（MTT）法藥物敏感性試驗

1.2.1.1 測定K562/A02細胞對ADM的耐藥倍數(shù)參照周建軍等［4］的改良MTT法，取細胞形態(tài)良好、對數(shù)生長期的K562細胞和K562/A02細胞分別經(jīng)600r/min離心；5min，吸去上清，用含10％小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞數(shù)為1.1×108個/L，接種于 96孔 培養(yǎng)板，每孔 90μL（1×104cells），同時每孔加入不同濃度的阿霉素10μL，使其在K562細胞終濃度為：0、0.25、0.5、1.0、2.0和4.0μmol/L，在K562/A02細胞的終濃度為：0、2.5、5.0、10.0、20.0 和 40.0μmol/L， 每 孔 終 體 積 為 100μL，每個濃度4個平行孔，其中阿霉素終濃度為0μmol/L的組為對照組，另外設(shè)調(diào)零孔（只加RPMI 1640培養(yǎng)液100μL，不加細胞和藥物），混勻后置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h；在每孔中加入5mg/mL的MTT磷酸鹽緩沖液20μL終止反應(yīng)，在同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)4-6h；每孔加入100μL三聯(lián)液過夜，使形成的甲瓚顆粒充分溶解；取出96孔培養(yǎng)板振蕩5min，然后在DG-5031型酶聯(lián)免疫測定儀上測定570nm光吸收值（A570值），分別計算各濃度阿霉素對兩種細胞生長的抑制率，細胞生長抑制率=（1-試驗組平均OD值/對照組平均OD值）×100％。根據(jù)Bliss方法，利用SPSS15.0軟件計算半數(shù)抑制濃度IC50值［5］，再根據(jù)IC50值計算耐藥倍數(shù)，耐藥倍數(shù)=耐藥細胞IC50值/敏感細胞IC50值。

1.2.1.2 測定FAT對K562細胞和K562/A02細胞的毒性作用 方法同1.2.1.1，F(xiàn)AT的終濃度為0、0.01、0.02、0.04和0.08mg/mL。

1.2.1.3 測定FAT對K562/A02細胞耐藥性逆轉(zhuǎn)的影響 參照李大成等［6］的分組方法，略作修改。用FAT≤IC10（抑制率≤10％時的濃度）的劑量進行耐藥逆轉(zhuǎn)試驗。收集對數(shù)生長期的K562細胞和K562/A02細胞，調(diào)細胞濃度為1.25×108cells/L，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔80μL（含1.0×104cells）。兩種細胞均分6組，試驗組Ⅰ加不同濃度的FAT 10μL和RPMI-1640 培養(yǎng)液10μL；試驗組Ⅱ同時加入不同濃度的FAT 10μL和不同濃度的阿霉素10μL，每一劑量復(fù)孔數(shù)為4。對照組Ⅰ不加細胞，只加RPMI-1640培養(yǎng)液100μL，用于調(diào)零；對照組Ⅱ為只加細胞不加任何藥物的陰性對照，加RPMI-1640培養(yǎng)液20μL；對照組Ⅲ為抗癌藥對照，加不同濃度的阿霉素10μL與RPMI-1640培養(yǎng)液10μL；對照組Ⅳ為逆轉(zhuǎn)劑陽性對照，加入終濃度為10μmol/L的VRP 10μL和不同濃度的阿霉素10μL，每孔終體積均為 100μL。方法同1.2.1.1。

逆轉(zhuǎn)倍數(shù)（fold reversal，F(xiàn)R）=逆轉(zhuǎn)前 IC50值 /逆轉(zhuǎn)后IC50值

1.2.2 DTNB法測定FAT對K562/A02細胞內(nèi)GSH表達的影響［7］取對數(shù)生長期的K562細胞和K562/A02細胞，調(diào)細胞濃度均為5.6×108cells/L，再將細胞懸液接種于24孔培養(yǎng)板，900μL（5×105cells）/孔，試驗分組：① FAT0.02mg/mL，② FAT0.04mg/mL，③ FAT0.08mg/mL，④ VRP 10μmol/L，按試驗分組分別加入相應(yīng)濃度的藥物工作液100μL/孔，混勻后在37℃、5％ CO2、飽和濕度的條件下培養(yǎng)，同時取對數(shù)生長期的K562/A02細胞和K562細胞，不加逆轉(zhuǎn)劑，作為對照，48h后收集細胞到離心管中，1500r/min離心2min，棄上清液，用冷PBS洗3次，再加PBS調(diào)整細胞數(shù)為1×109cells/L，用以測定 K562細胞細胞懸液，經(jīng)細胞破碎儀破碎細胞，1000 g離心和K562/A02細胞內(nèi)GSH含量。取上述各組細胞數(shù)為1×109cells/L的細胞懸液，經(jīng)細胞破碎儀破碎細胞，1000 g離心5min，取上清液200μL加100μL 10％磺基水楊酸混勻，1000 g離心5min，去蛋白，用上清液200μL測定OD值。方法同標準曲線的制作。

1.2.3 流式細胞儀測定K562細胞和K562/A02細胞內(nèi)羅丹明123含量 取對數(shù)生長期的K562細胞和K562/A02細胞，調(diào)整細胞數(shù)濃度為6.25×108cells/L，將細胞懸液接種于24孔培養(yǎng)板，800μL（5×105cells）/孔，兩種細胞各分5組：K562細胞，K+VRP 10μmol/L（K即K562細 胞 ），K+FAT0.02mg/mL，K+FAT0.04mg/mL，K+FAT0.08mg/mL；K562/A02細胞，K/A+VRP 10μmol/L（K/A即 K562/A02細胞），K/A+FAT0.02mg/mL，K/A+FAT0.04mg/mL，K/A+FAT0.08mg/mL，每組3個平行孔，按試驗分組分別加入相應(yīng)濃度的藥物工作液100μL，同時加入羅丹明123 100μL，終濃度為5μg/mL，終體積為1mL，混勻后置37℃，5％ CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)1h，加入冷PBS 2mL終止細胞代謝，收集細胞到離心管中，1500r/min離心2min，棄上清，冷PBS洗兩次，再加1mL PBS制成細胞懸液，采用美國Coulter公司生產(chǎn)的EPICS XL型流式細胞儀，以氬離子激光器為激發(fā)光源，激發(fā)波長為488nm，最大發(fā)射波長575nm，測定數(shù)據(jù)輸入計算機，用Multicycle軟件分析細胞羅丹明123含量。

2 結(jié)果

2.1 K562/A02細胞對ADM的耐藥倍數(shù)

K562/A02細胞在阿霉素10.0、20.0、40.0、80.0和160.0μmol/L各個濃度范圍的抑制率見表1，K562細胞在阿霉素0.25、0.5、1.0、2.0和 4.0μmol/L各個濃度范圍的抑制率見表2。根據(jù)Bliss方法計算半數(shù)抑制濃度IC50。結(jié)果顯示，阿霉素對K562細胞 的 IC50為 2.6μmol/L；K562/A02細 胞 的 IC50為80.0μmol/L。K562/A02細 胞 的 耐 藥 倍 數(shù) 是 30.7（表 3）。

表1 ADM對K562/A02細胞增殖的抑制作用（±s，n = 4）

表1 ADM對K562/A02細胞增殖的抑制作用（±s，n = 4）

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表2 FAT與阿霉素聯(lián)合作用對K562細胞增殖的抑制率（％，±s，n = 4）

表2 FAT與阿霉素聯(lián)合作用對K562細胞增殖的抑制率（％，±s，n = 4）

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2.2 FAT對K562細胞和K562/A02細胞增殖的影響

K562細胞和K562/A02細胞在FAT濃度為0.01、0.02、0.04和0.08mg/mL 濃度范圍的抑制率見表4。結(jié)果顯示，K562細胞和K562/A02細胞在0.01-0.08mg/mL范圍內(nèi)對細胞生長的抑制率均≤5％，可以認為在此濃度下對細胞無直接毒性作用，因此可作為逆轉(zhuǎn)劑的劑量。

表3 FAT與阿霉素聯(lián)合作用對K562/A02細胞的抑制率（％，±s，n= 4）

表3 FAT與阿霉素聯(lián)合作用對K562/A02細胞的抑制率（％，±s，n= 4）

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2.3 FAT對K562/A02細胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用

在 VRP（10μmol/L）、FAT（0.01、0.02、0.04 和0.08mg/mL）濃度時，ADM對K562/A02細胞的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為7.8、2.2、4.0、21.3和42.1。結(jié)果顯示，F(xiàn)AT與逆轉(zhuǎn)劑VRP一樣，可逆轉(zhuǎn)K562/A02細胞對ADM的耐藥性，其濃度為0.04和0.08mg/mL時逆轉(zhuǎn)倍數(shù)高于VRP；FAT可增強ADM對K562/A02細胞的生長抑制作用，且與劑量相關(guān)，而對K562細胞無顯著影響，詳見表2、表3和表5。

表4 FAT對K562細胞與K562/A02細胞增殖的抑制作用（±s，n = 4）

表4 FAT對K562細胞與K562/A02細胞增殖的抑制作用（±s，n = 4）

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2.4 FAT對K562/A02內(nèi)GSH含量的影響

DTNB法檢測結(jié)果（表6）顯示，K562/A02細胞 內(nèi) GSH 含 量（231.54μmol/106cells） 遠 遠高 于K562細 胞 內(nèi) GSH 含 量（58.03μmol/106cells）， 為K562細胞的3.99倍；FAT可減少K562/A02細胞內(nèi) GSH 含量，VRP（10μmol/L）、FAT（0.01、0.02、0.04和0.08mg/mL）作用48h后，K562/A02細胞內(nèi)GSH含量從231.54μmol/106cells分別減少到96.95、212.89、161和 122.35μmol/106cells，但仍高于 K562細胞內(nèi)GSH含量，說明FAT可減少K562/A02細胞內(nèi)GSH的表達，并且與劑量相關(guān)，但是效果沒有VRP顯著。

2.5 FAT對K562和K562/A02細胞內(nèi)羅丹明123積聚濃度的影響

表5 FAT對K562細胞與K562/A02細胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用

阿霉素、柔紅霉素是治療急性白血病的常用化療藥物，它們是通過抑制細胞內(nèi)DNA的合成而發(fā)揮作用，監(jiān)測白血病細胞內(nèi)的阿霉素或柔紅霉素濃度對臨床療效的預(yù)測有很大意義。同時阿霉素、柔紅霉素化療常導(dǎo)致白血病細胞的獲得性耐藥-多藥耐藥，耐藥的白血病細胞常使細胞內(nèi)藥物的排出增加，使細胞內(nèi)藥物濃度降低，導(dǎo)致化療失敗，所以抗癌藥物的濃度測定是多藥耐藥研究的重要課題［8］。用羅丹明123（Rhodamine 123）熒光染料作為被測抗癌藥物的代表在細胞中的積累。因為羅丹明123的結(jié)構(gòu)與阿霉素、柔紅霉素等眾多蒽環(huán)類抗癌藥物的結(jié)構(gòu)有許多相同之處（如有芳香雜環(huán)、有疏水性、有氮殘基等），并且有強熒光性，容易測定，而且即使?jié)舛群芨咭膊恢職⑺兰毎?］。

表6 FAT處理K562/A02細胞后的GSH含量分析

圖1 FAT對K562和K562/A02細胞內(nèi)羅丹明123含量的影響

圖2 流式細胞術(shù)分析FAT處理K562細胞后羅丹明123含量圖

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果（圖1）顯示，羅丹明123作用1h后，K562細胞內(nèi)含量（92.4％）明顯高于K562/A02 細 胞（0.02％）；VRP（10μmol/L）、FAT（0.02、0.04和0.08mg/mL）作用1h后，K562/A02細胞內(nèi)羅丹明123含量從0.02％分別增加到10.7％、18.3％、38.3％和50.4％，可見，F(xiàn)AT可增加K562/A02細胞內(nèi)的羅丹明123含量，與劑量相關(guān)；但FAT 對K562細胞內(nèi)羅丹明123含量沒有顯著影響（圖2和圖3）。

圖3 流式細胞術(shù)分析FAT處理K562/A02細胞后羅丹明123含量圖

3 討論

多藥耐藥（MDR）是指腫瘤細胞長期接觸某一化療藥物，不僅對此種化療藥物產(chǎn)生耐藥性，而且對其他結(jié)構(gòu)和功能不同的抗腫瘤藥物也產(chǎn)生交叉耐藥性的現(xiàn)象［10］，是造成化療失敗的主要原因。由于腫瘤MDR已涉及臨床常用的多種抗癌藥物，因此，盡快找到可以逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR的方法，以提高臨床療效，改善患者生存質(zhì)量，延長患者生存期十分緊迫［11］。

Tsurno等［12］發(fā)現(xiàn)鈣離子拮抗劑如維拉帕米通過與抗癌藥物競爭P-gp的相關(guān)結(jié)合位點增加抗癌藥物在細胞內(nèi)的潴留，Muller等［13］發(fā)現(xiàn)維拉帕米使mdrl基因轉(zhuǎn)錄下調(diào)逆轉(zhuǎn)MDR。鄧琦等［14］通過研究結(jié)果證實了通過CIK 與ADR 細胞對K562/ADR 細胞的先后作用，降低了其胞內(nèi)P-gp 的表達，提高了K562/ADR 細胞內(nèi)ADR 濃度，增強了ADR 對耐藥細胞的殺傷活性，但是對于多藥耐藥的非P-gp機制卻鮮有報道。

GSH由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的小分子三肽化合物，是細胞內(nèi)主要的含巰基肽，谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)是存在于動植物體內(nèi)的重要解毒系統(tǒng)。在人體內(nèi)，GSH 可與多種化療藥物等氧化性物質(zhì)結(jié)合，加速化療藥物的分解代謝，清除藥物細胞毒性代謝產(chǎn)物，增強對損傷DNA的修復(fù)，從而降低化療藥物的細胞毒性作用。細胞內(nèi)GSH水平增加與癌細胞對烷化劑、阿霉素及鉑類化療藥物耐藥性密切相關(guān)［15］，F(xiàn)ojo［16］也發(fā)現(xiàn)腫瘤 MDR 細胞內(nèi) GSH 含量明顯升高。本試驗也證實K562/A02細胞內(nèi)GSH含量遠遠高于K562細胞內(nèi)GSH含量。經(jīng)無毒劑量的FAT作用后，K562/A02細胞內(nèi)GSH含量減少，推測FAT可能通過減少GSH的表達或與GSH結(jié)合來降低細胞內(nèi)GSH含量，進而增加了羅丹明123在K562/A02細胞內(nèi)的積聚濃度從而逆轉(zhuǎn)MDR，并且與劑量相關(guān)。徐玉喬等［17］發(fā)現(xiàn)環(huán)孢霉素A可以使耐藥細胞GSH含量降低與自由基有關(guān)，劉明華等［18］發(fā)現(xiàn)川芎嗪通過影響GST降低耐藥細胞內(nèi)GSH含量，而FAT降低K562/A02細胞內(nèi)GSH含量的機制和能否在體內(nèi)試驗中逆轉(zhuǎn)多藥耐藥有待進一步研究。

本研究提示FAT與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用可能會增加白血病及其他腫瘤的化療療效。

4 結(jié)論

本試驗顯示了FAT作為有效多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑的一些藥理學(xué)特征：無毒劑量的FAT與化療藥物ADR聯(lián)合運用可以降低K562/A02細胞的IC50值，F(xiàn)AT還可以增加羅丹明123在K562/A02細胞內(nèi)的積聚濃度，降低K562/A02細胞內(nèi)GSH的含量，且呈劑量相關(guān)。推測FAT降低K562/A02細胞內(nèi)GSH的含量是FAT逆轉(zhuǎn)MDR的機制之一。

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