劉彥禮 李旭 蘇振成 徐明愷 張惠文

自1993年第一次出現(xiàn)有關(guān)熒光定量PCR技術(shù)的記錄，1996年ABI（Applied Biosystems）公司使熒光定量PCR（real-time fluomgenetic quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR）技術(shù)商業(yè)化，并制造出第一臺(tái)熒光定量PCR儀，迄今因該技術(shù)較以往核酸定量研究方法，如Nothern blotting、RNase-protection、Semiquantitative RT-PCR等，具有靈敏度高、特異性和可靠性好、自動(dòng)化程度高、具實(shí)時(shí)性和準(zhǔn)確性等特點(diǎn)，所以目前廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域［1-4］。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在PCR定性技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的核酸定量技術(shù)。它是通過(guò)在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)（探針類和染料類），利用每個(gè)循環(huán)末對(duì)熒光信號(hào)積累的捕捉來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，從而建立起熒光量與初始模板量的對(duì)應(yīng)關(guān)系，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法［5］。對(duì)于熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析方法包括絕對(duì)定量和相對(duì)定量?jī)煞N。前者是應(yīng)用精確定量的標(biāo)準(zhǔn)品，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，以此來(lái)定量未知樣品中初始基因拷貝數(shù)。雖然該方法能夠直接得到目的基因的拷貝數(shù)，且具有穩(wěn)定、直觀等優(yōu)點(diǎn)，但是其數(shù)據(jù)可靠的前提是得到精確定量的標(biāo)準(zhǔn)品，鑒于目前核酸定量技術(shù)的不足，標(biāo)準(zhǔn)品的制備無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，所以數(shù)據(jù)缺乏可比性；而且標(biāo)準(zhǔn)品與試驗(yàn)樣品擴(kuò)增效率的差異也影響了該方法應(yīng)用；再者絕對(duì)定量也不適合高通量的定量分析。而相對(duì)定量在一定程度上彌補(bǔ)了絕對(duì)定量的不足，其是指在測(cè)定目的基因的同時(shí)測(cè)定一內(nèi)源性穩(wěn)定表達(dá)內(nèi)參基因，通過(guò)比較處理前后的目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因歸一化的比值，來(lái)衡量目的基因在處理前后的表達(dá)差異，并不需要確定目的基因具體的拷貝數(shù)。盡管相對(duì)定量存在著一定的缺點(diǎn)，但其仍是目前處理熒光定量數(shù)據(jù)的主流方法，尤其是定量mRNA拷貝數(shù)［6］。本試驗(yàn)在用上述3種方法就行處理數(shù)據(jù)的過(guò)程中，假定未稀釋樣品為對(duì)照（control），不同的稀釋梯度的樣品為處理（sample），理論上目的基因IL-10的變化率為1。最終通過(guò)比較不同方法計(jì)算的結(jié)果與理論值的差異進(jìn)行分析，旨在探討動(dòng)力學(xué)模型在定量結(jié)果的可靠性、方便性及經(jīng)費(fèi)節(jié)約方面的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器 Taq DNA 聚合酶、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（Perfect Real Time）購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；ABI 7000型實(shí)時(shí)熒光定量 PCR擴(kuò)增儀為美國(guó)ABI公司生產(chǎn)；Univeral Hood SN-75S型紫外凝膠成像系統(tǒng)為美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)。

1.1.2 試驗(yàn)樣品 本試驗(yàn)所應(yīng)用的內(nèi)參基因（β-actin）與目的基因（IL-10）的cDNA由本課題組通過(guò)反轉(zhuǎn)錄得到，并對(duì)得到的cDNA進(jìn)行5倍的梯度稀釋。

1.2 方法

1.2.1 熒光定量PCR反應(yīng)條件確定 利用體外轉(zhuǎn)錄生成的 cDNA 作為模板，從多次重復(fù)性試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，該檢測(cè)方法最適反應(yīng)總體積25μL，其中模板1μL；最適的引物濃度為0.4μmol/L，其余組分濃度依據(jù)試劑盒使用說(shuō)明。最適循環(huán)參數(shù)為：95℃ 30；之后 95℃ 5s，60℃ 30s，72℃ 31s，40 個(gè)循環(huán) ；最終72℃ 5min。PCR反應(yīng)完成后以60℃為起點(diǎn)做產(chǎn)物的熔解曲線。β-actin特異性引物（F：5'-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3'，R：5'-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3'）與IL-10的特異性引物（F：5'-ACCTGGTAGAAGTGATGCCCCAGGCA-3'，R ：5'-CTATGCAGTTGATGAAGATGTCAAA-3'），擴(kuò)增片段大小分別為348bp和237bp［7］，由華大基因合成。

1.2.2 相對(duì)定量方法

1.2.2.12－△△Ct法 該方法是傳統(tǒng)的處理熒光定量數(shù)據(jù)的方法，其通過(guò)假設(shè)目標(biāo)基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增效率相等且均為100％，即Etarget=Eref= 1［8］，這樣大大簡(jiǎn)化了試驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理過(guò)程，其數(shù)學(xué)模型基于PCR指數(shù)擴(kuò)增的公式：

Xn= X0×（1+ E）n

其中Xn是循環(huán)數(shù)為n時(shí)基因的拷貝數(shù)，X0為初始基因拷貝數(shù)，E為基因的擴(kuò)增效率，Ct代表目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，因此

XCt-target= X0-target×（1+ Etarget）Ct-target=Ktarget

其中XCt-target為目標(biāo)基因達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)的拷貝數(shù)，X0-target為目標(biāo)基因初始拷貝數(shù)，Ct-target為目標(biāo)基因擴(kuò)增到設(shè)定閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)，對(duì)于目標(biāo)基因和內(nèi)參基因來(lái)說(shuō)，達(dá)到閾值時(shí)其基因拷貝數(shù)固定，所以Ktarget為常數(shù)，同理：

其中X0-target/X0-ref代表經(jīng)過(guò)內(nèi)參基因歸一化處理的初始目標(biāo)基因拷貝數(shù)的比值，用S表示；△Ct表示目標(biāo)基因和內(nèi)參基因Ct值的差異，△Ct = Cttarget － Ct-ref；Ktarget/Kref為一常數(shù)，設(shè)為K，對(duì)公式進(jìn)行變形得：

S = K × 2－△Ct

因此用處理后樣品的Ssample除以處理前樣品的Scontrol得到：

公式中的－△△Ct = △Ctsample－△Ctcontrol

1.2.2.2 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法 該方法應(yīng)用上述準(zhǔn)備好的梯度稀釋cDNA分別做出目的基因與管家基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后從各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出初始模板量，經(jīng)管家基因歸一化處理后，求出目的基因的相對(duì)含量［9，10］。其也基于PCR指數(shù)擴(kuò)增的公式：

Xn= X0×（1 + E）n

其中Xn是循環(huán)數(shù)為n時(shí)基因的拷貝數(shù)，X0為初始基因拷貝數(shù)，E為基因的擴(kuò)增效率，當(dāng)熒光值達(dá)到閾值時(shí)其數(shù)學(xué)公式表示如下：

XCt= X0×（1 + E）Ct

兩邊同時(shí)取對(duì)數(shù)：log XCt= Ct×log（1 + E）+ log X0，變形得：

Ct = － log X0/log（1+E）＋ log XCt/log（1+ E）

由于達(dá)到閾值時(shí)，XCt和E為常數(shù)，所以設(shè)

a = － 1/log（1 + E）；b = log XCt/log（1 + E）

則公式轉(zhuǎn)化為線性方程：

Ct = a×log X0＋ b

由此構(gòu)建出基因初始拷貝數(shù)與Ct的線性關(guān)系。從而通過(guò)求出未知樣本內(nèi)目標(biāo)基因的Ct值即可求出目標(biāo)基因的相對(duì)初始拷貝數(shù)。通過(guò)上述模型，我們進(jìn)行目標(biāo)基因的相對(duì)定量：

由以上公式可以求出X（target-control）（處理前樣品中目標(biāo)基因的相對(duì)初始拷貝數(shù)）、X（ref-control）、X（target-sample）和X（ref-sample），歸一化處理表示目的基因在處理前后的表達(dá)差異率Ratio為：

Ratio =［X（target-sample）/X（ref-sample）］/［X（target-control）/X（ref-control）］

將 a = － 1 /log（1 + E）；b = log XCt/log（1 + E）帶入公式后，整理得：

Ratio =（1+Etarget）△Ct（control-sample）/（1+Eref）△Ct（control-sample）

若假設(shè)上述公式Etarget=Eref= 1，則ratio =2－△△Ct，其中－△△ Ct = △ Cttarget－△ Ctref，因此可以將2－△△Ct法作為雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法的一個(gè)特例。

1.2.2.3 基于動(dòng)力學(xué)的相對(duì)定量方法 通過(guò)上述兩種計(jì)算方法的比較，可以明確基因的擴(kuò)增效率對(duì)后期數(shù)據(jù)處理的影響，并且這種影響通過(guò)指數(shù)形式進(jìn)行放大。上述兩種計(jì)算方法假定PCR反應(yīng)在指數(shù)擴(kuò)增期時(shí)效率相等，但實(shí)際情況卻是在制備樣品cDNA的過(guò)程中，已經(jīng)將不同濃度的鹽、酚、氯仿、乙醇等帶入到樣品中，這些有毒物質(zhì)將不同程度的抑制酶的活性，使實(shí)際的擴(kuò)增效率低于理想值；并且在樣品的梯度稀釋過(guò)程中，這些有毒物質(zhì)也被稀釋，

因此減少了對(duì)酶的抑制，這就造成了梯度稀釋樣品本身的擴(kuò)增效率就不一致，從而使通過(guò)雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法得到的值與真實(shí)值有差異［11］。針對(duì)這種情況，近年來(lái)許多文獻(xiàn)［12-16］提出通過(guò)模擬熒光定量PCR儀所給出的樣品擴(kuò)增曲線建立熒光量與Ct值之間的直線或曲線，以此來(lái)獲得反應(yīng)的擴(kuò)增效率或基因初始拷貝數(shù)，并且設(shè)計(jì)出一系列方便試驗(yàn)人員進(jìn)行試驗(yàn)的模型和軟件。該模型假定在單一PCR擴(kuò)增反應(yīng)的指數(shù)期內(nèi)期擴(kuò)增效率恒定，建立熒光量的對(duì)數(shù)值與Ct值之間的線性關(guān)系，從而獲得反應(yīng)擴(kuò)增效率，經(jīng)管家基因歸一化處理后得到目的基因在處理前后的表達(dá)差異。其模型與雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法相似，但不是通過(guò)對(duì)樣品梯度稀釋獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線間接獲得擴(kuò)增效率，而是利用每個(gè)梯度樣品的真實(shí)擴(kuò)增曲線來(lái)獲得我們需要的熒光量和與之對(duì)應(yīng)的Ct值，從而直接得出該梯度PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效率。Ramakers等［8］在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)出軟件LinRegPCR以為廣大研究者提供方便。由假設(shè)可知：

Fn= F0×（1 + E）n

其中Fn是循環(huán)數(shù)為n時(shí)基因擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光量，F(xiàn)0為初始基因的熒光量，E為基因的擴(kuò)增效率。當(dāng)熒光值達(dá)到閾值時(shí)數(shù)學(xué)公式表示如下：

FCt= F0×（1 + E）Ct

兩邊同時(shí)取對(duì)數(shù)：log FCt= Ct×log（1 + E）+log F0變形得：Ct = log FCt/log（1 + E）－log F0/log（1 + E）

因?yàn)槭菃我环磻?yīng)模板量恒定，所以log F0為一常數(shù)，且E值恒定。

若設(shè) a = 1/log（1 + E）；b = log F0/log（1 + E），則公式簡(jiǎn)化為：

Ct = a × log FCt－ b

當(dāng)在擴(kuò)增的指數(shù)期，通過(guò)取一系列的熒光值以及與之對(duì)應(yīng)的Ct值，線性擬合求出E值后，帶入公式：Ratio =（1+Etarget）△ Ct（control-sample）/（1+Eref）△ Ct（control-sample）

通過(guò)Ratio值反應(yīng)出目的基因在處理前后的表達(dá)差異。

2 結(jié)果

2.1 熒光定量PCR操作特異性與重復(fù)性檢驗(yàn)

試驗(yàn)通過(guò)熒光定量PCR給出的熔解鏈曲線（圖1），并輔助以瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證該方法的特異性（圖2），從圖1中熔解鏈曲線只有單一的峰以及圖2中瓊脂糖凝膠電泳跑出的單一條帶，這些都很好的說(shuō)明了所采用引物的高特異性；同時(shí)通過(guò)對(duì)同一樣品在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上做3個(gè)重復(fù)以驗(yàn)證方法的可重復(fù)性和穩(wěn)定性，通過(guò)特異性和重復(fù)性檢驗(yàn)很好地保障了試驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。

圖1 β-actin和IL-10熔解鏈曲線

圖2 熒光定量PCR儀擴(kuò)增結(jié)果

2.2 梯度稀釋樣品熒光定量結(jié)果

對(duì)于樣品cDNA進(jìn)行5倍梯度稀釋后，每個(gè)梯度3個(gè)重復(fù)，測(cè)得相應(yīng)β-actin和IL-10的平均Ct值如表1所示。

2.3 三種相對(duì)定量方法結(jié)果

2.3.12－△△Ct法定量結(jié)果 由表3數(shù)據(jù)通過(guò)2－△△Ct方法計(jì)算出目的基因IL-10通過(guò)內(nèi)參基因β-actin歸一化處理后變化率如表2所示。

2.3.2 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量結(jié)果 由表3數(shù)據(jù)構(gòu)建β-actin和IL-10的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3），利用線性擬合得到的斜率計(jì)算出Eβ-actin=0.5959，EIL-10=0.6886；通過(guò)前述公式計(jì)算出目的基因IL-10經(jīng)內(nèi)參基因β-actin歸一化處理后變化率如表3所示。

2.3.3 基于動(dòng)力學(xué)的相對(duì)定量方法結(jié)果 根據(jù)動(dòng)力學(xué)相對(duì)定量方法原理，在β-actin和IL-10擴(kuò)增曲線的直線部分（圖4-a）隨機(jī)采集5個(gè)點(diǎn)，獲得與之對(duì)應(yīng)的熒光量與Ct值，線性擬合得到相應(yīng)的擴(kuò)增效率（圖4-b），通過(guò)相應(yīng)公式得出目的基因IL-10經(jīng)內(nèi)參基因β-actin歸一化處理后變化（表4）。

表1 熒光定量5倍梯度稀釋后樣品的數(shù)據(jù)

表2 2－△△Ct法定量結(jié)果

表3 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量結(jié)果

3 討論

3種模型處理數(shù)據(jù)的結(jié)果見表5。理論上同一樣品梯度稀釋后，其作為樣品的各個(gè)梯度中目的基因經(jīng)表達(dá)差異率（Ratio）和經(jīng)內(nèi)參基因歸一化處理后相對(duì)于對(duì)照應(yīng)為常數(shù)1。相同的原始數(shù)據(jù)通過(guò)3種模型處理后的定量結(jié)果與理論值比較，從均值、方差以及變異系數(shù)方面都說(shuō)明動(dòng)力學(xué)方法要優(yōu)于雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法和2－△△Ct法。動(dòng)力學(xué)方法與雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算出內(nèi)參基因與目的基因的擴(kuò)增效率均小于1，這與實(shí)際PCR過(guò)程的動(dòng)力學(xué)相符，也直接說(shuō)明了2-△△Ct法本身的前提條件就存在著不足，而且動(dòng)力學(xué)方法所計(jì)算得到的每個(gè)梯度擴(kuò)增效率隨著稀釋梯度的增加也隨之增加，進(jìn)一步證明了模板制備中存在的有毒物質(zhì)在PCR反應(yīng)過(guò)程中對(duì)酶活性的影響。

圖3 β-actin和IL-10的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 β-actin和IL-10的擴(kuò)增曲線及直線部分線性擬合

表4 動(dòng)力學(xué)方法定量結(jié)果

表 5 三種數(shù)學(xué)模型處理結(jié)果的比較

但因2－△△Ct法對(duì)假設(shè)的簡(jiǎn)化使得該方法只需一個(gè)變量（Ct值），即可快速獲得結(jié)果；同時(shí)，目的基因表達(dá)差異率越大該方法的可靠性就越高，故現(xiàn)在仍被廣泛使用；雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法通過(guò)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得內(nèi)參基因與目的基因的擴(kuò)增效率，然而標(biāo)準(zhǔn)品稀釋的同時(shí)也稀釋了抑制PCR反應(yīng)的有毒物質(zhì)，使由該方法得到的擴(kuò)增效率與真實(shí)值有一定誤差，并且通過(guò)這種方法所構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線消耗了更多的定量試劑，增加了試驗(yàn)成本，所以現(xiàn)在應(yīng)用較少。隨著熒光定量上游技術(shù)的突破，試驗(yàn)所得原始數(shù)據(jù)的可靠性越來(lái)越高，而動(dòng)力學(xué)模型因以實(shí)時(shí)定量曲線為基礎(chǔ)通過(guò)線性擬合計(jì)算得到每一個(gè)基因的擴(kuò)增效率，所以通過(guò)模型有效的屏蔽了PCR反應(yīng)過(guò)程中潛在的影響因素，計(jì)算所得擴(kuò)增效率的可靠性也隨之越來(lái)越高；同時(shí)因省去標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算擴(kuò)增效率，減少了試劑的消耗，降低了試驗(yàn)成本，節(jié)省了有限的模板；而且針對(duì)動(dòng)力學(xué)模型使用過(guò)程中遇到的線性擬合的問(wèn)題，已經(jīng)開發(fā)出多款供研究者利用的軟件，如LinRegPCR。

4 結(jié)論

在熒光定量PCR相對(duì)定量的數(shù)據(jù)處理過(guò)程中，通過(guò)實(shí)例對(duì)3種處理數(shù)據(jù)模型的精確性進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)動(dòng)力學(xué)模型＞雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法＞2－△△Ct法；此外應(yīng)用動(dòng)力學(xué)模型在節(jié)約試驗(yàn)成本以及模板等方面的優(yōu)勢(shì)也使其成為熒光定量研究領(lǐng)域中的一個(gè)熱點(diǎn)，圍繞其開發(fā)的多款軟件也表明該模型具有很大的發(fā)展前景。

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