王紅霞 王華明 張大龍 羅成

木聚糖是細(xì)胞中最具代表性的半纖維素，約占細(xì)胞干重的35％，可以作為再生資源被利用［1］。木聚糖的完全降解需要木聚糖水解酶系中各種酶相互之間協(xié)同完成，起主要作用的是內(nèi)切β-1，4-木聚糖酶（1，4-β-D-木聚糖酶水解酶，EC3.2.1.8），簡稱木聚糖酶，是當(dāng)前木聚糖酶類的研究熱點(diǎn)。木聚糖酶作用于木聚糖和長鏈木聚糖，從β-1，4-木聚糖主鏈的內(nèi)部切割木糖苷鍵，從而使木聚糖降解為木寡糖，其水解產(chǎn)物主要為木二糖與木二糖以上的寡聚木糖，也有些可以產(chǎn)生少量木糖和阿拉伯糖。

木聚糖酶是涉及半纖維素水解的主要酶，因而具有重要的應(yīng)用價(jià)值。研究表明，木聚糖酶在許多工業(yè)中都有廣泛的用途，如食品、動(dòng)物飼料、制漿造紙、環(huán)境等［2，3］。但是，木聚糖酶要實(shí)現(xiàn)有效應(yīng)用，要求其具有良好的酶學(xué)性質(zhì)，在不同領(lǐng)域應(yīng)用要求其具有不同酶學(xué)性質(zhì)［4］。自20世紀(jì)70年代末，80年代初開展木聚糖酶基因的研究工作以來，已有上百種來自真菌和細(xì)菌的木聚糖酶基因被克隆并在大腸桿菌中表達(dá)［5-10］。

我國對(duì)木聚糖酶的研究最近十幾年才開始，基本上還限于天然菌株的篩選、酶的純化及酶學(xué)性質(zhì)的分析上［11，12］。目前大多是從木霉、黑曲霉中克隆木聚糖酶基因，還沒有葡萄穗霉木聚糖酶基因克隆表達(dá)的報(bào)道［13-16］。葡萄穗霉具有嗜纖維性，且對(duì)于堿性條件也有較好的耐受性［17］。本研究將從葡萄穗霉中克隆得到的木聚糖酶基因xya6205，利用黑曲霉（G1）表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)胞外分泌表達(dá)，并對(duì)所產(chǎn)重組木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒 木聚糖酶基因xya6205為本實(shí)驗(yàn)室保藏的葡萄穗霉中克?。淮竽c桿菌菌株E.coli Trans5α購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；黑曲霉G1為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 試劑 限制性內(nèi)切酶SnaBⅠ、XbaⅠ、T4連接酶、Gel Extraction Kit、PCR Kit、PlasmidKit等均購自Fermentas公司；木聚糖酶底物樺木木聚糖（birch wood xylan）購 自 Sigma公 司；KOD-plus購 自TO-YOBO公司；其它生化試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB、CMC、amds乙酰胺選擇培養(yǎng)基［18］、promosoy specialmedium 產(chǎn)酶培養(yǎng)基、CSL生長培養(yǎng)基均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)配置。

1.2 方法

1.2.1 木聚糖酶基因xya6205在葡萄穗霉全基因組上的挖掘 通過比較基因組學(xué)，葡萄穗霉全基因組上部分基因功能注釋可能為木聚糖酶，其中13個(gè)序列可能為β-內(nèi)切木聚糖酶。為了克隆最有可能的內(nèi)切木聚糖酶基因，采用預(yù)先建立內(nèi)切木聚糖酶基因序列庫，并將相應(yīng)序列分別進(jìn)行本地BLASTp，同時(shí)將這些序列在NCBI進(jìn)行在線BLASTp。將本地及在線BLAST結(jié)果結(jié)合分析，確定最有可能的內(nèi)切木聚糖酶序列進(jìn)行克隆。

1.2.2 重組質(zhì)粒pGm-xya6205的構(gòu)建和克隆 根據(jù)挑選的xya6205基因的序列以及表達(dá)載體pGm的多克隆位點(diǎn)的特征，設(shè)計(jì)引物（表1）由上海Invitrogen公司合成。

表1 克隆xya6205使用的引物

PCR擴(kuò)增得到的木聚糖酶基因xya6205，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收純化，用SnaB I和Xba I雙酶切，連接到載體pGm多克隆位點(diǎn)，得到重組質(zhì)粒pGmxya6205。將其向感受態(tài)大腸桿菌Trans 5α中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，30℃倒置過夜培養(yǎng)16h，挑取適中大小的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。驗(yàn)證正確的用加氨芐的LB培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后，提取質(zhì)粒。

1.2.3 黑曲霉重組表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定 黑曲霉原生質(zhì)體的制備參照Wernars等的方法操作［19］。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGm-xya6205與100μL原生質(zhì)體混合，并加入12.5μL PEG緩沖液（PEG4000 50％，CaCl20.05mol/L，Tris 1mol/L，pH7.5），冰上靜置20min后再加入1mL上述PEG緩沖液，2mL山梨醇溶液（山梨醇1.2mol/L，CaCl20.05mol/L，Tris 1mol/L，pH7.5），并與融化的AMDS上層培養(yǎng)基混勻，立即平均鋪于3個(gè)AMDS 下層培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)5-7d。

挑取轉(zhuǎn)化子到二次驗(yàn)證板上，同時(shí)挑取陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，30℃繼續(xù)培養(yǎng)，若能繼續(xù)生長則為陽性轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行菌絲PCR驗(yàn)證。菌絲PCR驗(yàn)證操作過程參見Finnzymes的Phire?plant direct PCR kit操作說明書。驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接到斜面上保存，同時(shí)保存孢子懸浮液，用甘油管儲(chǔ)存于-80℃冰箱。

1.2.4 重組黑曲霉工程菌株的表達(dá) 從斜面上用無菌竹簽挑取孢子，接種到25mL的產(chǎn)酶培養(yǎng)基三角瓶中，搖床培養(yǎng)，30℃，200r/min；3d后取發(fā)酵液，離心，10000r/min，8.5min，取上清 30μL，加入 10μL 4倍上樣buffer（已煮沸），水浴煮沸5min；10000r/min離心1min，待用。

配置SDS-PAGE分離膠和濃縮膠，待凝固后點(diǎn)樣，加入緩沖液，接通電源，首先80 v電壓跑膠，待蛋白樣跑出凝縮膠后改電壓為120 v，直至其跑到最底線；考馬斯亮藍(lán)染色 30min；脫色液脫色3次，每次30min，最后用清水浸泡過夜。

1.2.5 重組黑曲霉表達(dá)產(chǎn)物酶學(xué)性質(zhì)分析 采用DNS法測(cè)定木聚糖酶的活性［20］。酶活定義為：在一定條件下（pH5.5，37℃），每分鐘產(chǎn)生 1μmol木糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（1U）。采用Brandford法測(cè)定發(fā)酵液中的蛋白含量。酶活力和酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，取平均值計(jì)算。

最適pH的測(cè)定：配置不同pH2.7-9.0的緩沖液，在37℃條件下分別測(cè)定不同pH值下重組酶的活性。以最高酶活為100％計(jì)。

最適溫度的測(cè)定：在最適pH條件下，測(cè)定不同溫度（30-80℃）下重組酶的活性。以最高酶活為100％計(jì)。

酶的耐熱性試驗(yàn)：重組酶在最適反應(yīng)溫度水浴條件下處理5、10、15、20、25和30min后，在最適反應(yīng)條件下測(cè)定殘余酶活，以未處理為100％計(jì)。

酶的pH穩(wěn)定性試驗(yàn)：在室溫（25℃）條件下，將重組酶液在不同pH緩沖液中（pH2.8-8.2）處理18h后，取2mL在酶活測(cè)定反應(yīng)體系中測(cè)定其殘余酶活，以未處理為100％計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 黑曲霉重組表達(dá)載體的構(gòu)建

經(jīng)PCR擴(kuò)增得到了大小正確（1699bp）的xya6205基因（圖1）。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析

挑取5個(gè)大腸桿菌菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，其中一個(gè)菌落得到了大小正確的xya6205基因（圖2）。將該重組質(zhì)粒pGm-xya6205寄送到博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用DNAMAN軟件與正確序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)沒有發(fā)生突變，完全正確，重組質(zhì)粒pGm-xya6205構(gòu)建成功。

圖2 菌落PCR鑒定

2.2 黑曲霉的轉(zhuǎn)化

重組質(zhì)粒pGm-xya6205以同源重組的方式進(jìn)入到黑曲霉GAP3染色體上，因pGm上具有來自構(gòu)巢曲霉的amds基因，可以利用乙酰胺作為唯一氮源，因而試驗(yàn)中采用amds培養(yǎng)基培養(yǎng)轉(zhuǎn)化黑曲霉，可初步方便快捷的篩選出含pGm-xya6205的重組菌株。

篩選后共得到25個(gè)陽性轉(zhuǎn)化子。

2.3 重組黑曲霉菌株的PCR快速鑒定

將篩選到的25株轉(zhuǎn)化子，分別進(jìn)行菌絲PCR快速驗(yàn)證，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，有18株得到了1699bp的xya6205基因條帶（圖3）。

圖3 黑曲霉轉(zhuǎn)化子菌絲PCR快速鑒定

2.4 重組蛋白的表達(dá)

挑取8株菌絲PCR快速驗(yàn)證呈陽性的轉(zhuǎn)化子及陰性G1進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，SDS-PAGE（圖4）顯示，有6株在25kD處出現(xiàn)條帶，而陰性無目的條帶。

2.5 重組酶酶學(xué)性質(zhì)的分析

DNS法測(cè)得1L發(fā)酵液在第5天時(shí)酶活達(dá)到最高（392U/mg）。重組酶的最適pH值為5.8，如圖5所示，在pH5.0-9.0范圍內(nèi)酶活均比較高，尤其是在堿性范圍內(nèi)，仍有60％以上的酶活。

圖4 重組木聚糖酶表達(dá)的SDS-PAGE

圖5 重組木聚糖酶的最適反應(yīng)pH

重組酶最適溫度為50℃（圖6），在60℃仍有80％酶活，70℃時(shí)下降較快，殘余酶活僅為29.9％。

圖6 重組木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度

酶的耐熱性試驗(yàn)（圖7）表明，重組酶在50℃下保持5min時(shí)，殘余酶活還剩80％左右，超過30min酶活僅有23％。另外將重組酶分別在30、40、50、60、70和80℃下金屬浴處理30min后，測(cè)定剩余酶活，以未處理的為100％計(jì)，在40℃以下酶活性幾乎無損失（圖8）。

圖7 重組木聚糖酶在50℃的熱穩(wěn)定性

圖8 重組木聚糖酶溫度穩(wěn)定性

重組酶的pH穩(wěn)定性如圖9所示，在pH5.2-8.2環(huán)境中處理18h后酶活較穩(wěn)定，存在70％以上的殘余酶活，pH6.8時(shí)最高，為83％。

圖9 重組木聚糖酶的pH穩(wěn)定性

3 討論

黑曲霉表達(dá)系統(tǒng)是近年來逐漸廣泛使用的新型外源蛋白真核基因表達(dá)系統(tǒng)之一。該表達(dá)系統(tǒng)具有以下特有優(yōu)點(diǎn)：表達(dá)量大；胞外分泌率高；蛋白質(zhì)分子折疊和修飾系統(tǒng)接近高等真核細(xì)胞；表達(dá)的外源蛋白具有天然活性；良好的安全性［21］。

絲狀真菌葡萄穗霉具有嗜纖維性和嗜堿性，可以在低氮條件下生長，適宜條件下能夠產(chǎn)生多種真菌毒素和其它活性產(chǎn)物。目前還沒有葡萄穗霉木聚糖酶基因克隆表達(dá)的報(bào)道。本試驗(yàn)中，將從葡萄穗霉中克隆得到的木聚糖酶基因xya6205（不含自身啟動(dòng)子）插入到pGm載體的多克隆位點(diǎn)，利用來自于黑曲霉glaA的強(qiáng)啟動(dòng)子，使目的基因在黑曲霉G1中得到了高效分泌表達(dá)。重組木聚糖酶產(chǎn)量達(dá)392U/mg，表達(dá)產(chǎn)物具有生物活性，為進(jìn)一步的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)提供了良好的出發(fā)菌株。

該木聚糖酶的最適溫度為50℃，最適pH為5.8。在pH5.0-9.0范圍內(nèi)酶活均比較高，尤其是在堿性范圍內(nèi)，仍有60％以上的酶活，其堿性穩(wěn)定性也較高，在pH8.2環(huán)境中處理18h后，仍有70％殘余酶活。在造紙工業(yè)中，堿性木聚糖酶作為紙漿預(yù)漂白助劑，可以提高紙漿生產(chǎn)能力和紙漿亮度，降低廢水中有機(jī)氯含量。重組酶優(yōu)良的堿性穩(wěn)定性為其工業(yè)應(yīng)用的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究克隆、異源表達(dá)了具有活性的葡萄穗霉木聚糖酶基因，其粗酶液木聚糖酶比活達(dá)392U/mg，最適溫度為50℃，最適pH為5.8，在不同pH緩沖液中處理18h后，最高仍有83％殘余酶活，是一種新型堿性木聚糖酶。

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