榮曼 張銳虎 劉田福

甘丙肽是一種廣泛分布外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)肽，研究發(fā)現(xiàn)，它具有調(diào)節(jié)胰腺分泌，促進(jìn)食欲，抑制脂肪組織中抵抗素基因的表達(dá)，影響胃腸蠕動(dòng)，提高垂體生長(zhǎng)激素，催乳素，促黃體生成激素釋放等功能，尤其在學(xué)習(xí)，記憶，痛覺(jué)和脊神經(jīng)反射等神經(jīng)功能方面發(fā)揮重要作用。國(guó)外不僅利用外源甘丙肽，甘丙肽拮抗或者激動(dòng)劑深入研究甘丙肽在神經(jīng)組織和外周的作用，并且已成功建立了甘丙肽過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠［1］；國(guó)內(nèi)也在甘丙肽對(duì)阿爾茨海默癥，抑郁癥，癲癇等的影響方面取得了很大進(jìn)展，但仍缺乏內(nèi)源性過(guò)表達(dá)的甘丙肽用于進(jìn)一步的疾病模型研究。本課題將延用本實(shí)驗(yàn)室已有的科研成果——重組克隆質(zhì)粒pUC18-PDGF-GAL［2］，以其為模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的片段PDGF-GAL，然后將其定向克隆至真核表達(dá)載體pcDNA 3.1獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-PDGF-GAL，采用脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞實(shí)現(xiàn)甘丙肽基因的過(guò)表達(dá)，為下一步經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定細(xì)胞克隆從而深入研究過(guò)表達(dá)甘丙肽的相關(guān)作用機(jī)制做準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 N-2a購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒 pcDNA3.1，由本實(shí)驗(yàn)室所保存，大腸桿菌DH5α，pMD19-T simple vector均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3 試劑和培養(yǎng)基 DNA A-Tailing Kit，RT-PCR Kit，RNAiso Reagent均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；Bgl II和Xho I限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自NEB公司；Plasmid Mini Kit 購(gòu)自O(shè)mega公司；澳洲血源特級(jí)胎牛血清購(gòu)自北京元亨金馬生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；LipofectamineTM2000購(gòu)自Invitrogen公司；小鼠甘丙肽ELISA試劑盒48T購(gòu)自上海，屬進(jìn)口分裝。

1.1.4 主要引物 常規(guī)PCR引物、RT-PCR均參照GenBank中GAL基因和cDNA的標(biāo)準(zhǔn)序列，使用Primer Premier5.0，Oligo6.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)分析，PCR正向引物 F：5'-GAAGATCTGGATCCACAGTCTCCTGAGTA-3'，反向引物 R：5'-CCGCTCGAGCAGTCCCAGATACTTGCTAG-3'；RT-PCR正向引物F：5'-GCAGTAAGCGACCATCCAGC-3'，反向引物 R：5'-AGGACACACGTGCACAGTGG-3'；內(nèi)參正向引物F：5'-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3'，反向引物R：5'-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3'，引物由 Invitrogen 公司合成。

1.2 方法

1.2.1 目的片段PDGF-GAL的擴(kuò)增 以pUC18-PDGF-GAL質(zhì)粒為模板，PCR獲得5'端具有Bgl II酶切位點(diǎn)，3'端具有Xho I酶切位點(diǎn)的目的片段。

1.2.2 重組質(zhì)粒pMDT-PDGF-GAL的構(gòu)建 膠回收目的片段，經(jīng)加A反應(yīng)，與T載體經(jīng)T4連接酶16℃過(guò)夜連接，并以線性T載體自連為陰性對(duì)照，連接摩爾比為3∶1，經(jīng)轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，氨芐抗性篩選，擴(kuò)大培養(yǎng)等過(guò)程，對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行PCR法，酶切鑒定后經(jīng)測(cè)序終獲得pMDT-PDGFGAL。

1.2.3 GAL特異性表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 取最終測(cè)序正確的質(zhì)粒pMDT-PDGF-GAL和pcDNA3.1分別用Bgl II和Xho I酶雙酶切后經(jīng)T4連接酶16℃過(guò)夜連接，并以線性化pcDNA3.1和pMDT-PDGF-GAL自連為陰性對(duì)照，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，氨芐抗性篩選，擴(kuò)大培養(yǎng)等過(guò)程，對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行PCR和酶切鑒定后再送交測(cè)序中心，將最終鑒定正確的重構(gòu)質(zhì)粒命名為pcDNA-PDGF-GAL。

1.2.4 細(xì)胞的復(fù)蘇、傳代及凍存 從液氮中取出凍存細(xì)胞立即放入40℃水浴，震蕩使其快速溶解1min，然后移入含有9mL完全培養(yǎng)基的離心管中，室溫下1200r/min離心吹吸混勻后移入培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。N-2a細(xì)胞用全血清DMEM培養(yǎng)液（10％胎牛血清，100U/mL青霉素，100μg/mL鏈霉素）在75cm2培養(yǎng)瓶中附壁生長(zhǎng)培養(yǎng)，細(xì)胞達(dá)到80％融合時(shí)以1∶3進(jìn)行傳代。選第3-6代細(xì)胞以2×107進(jìn)行凍存，凍存前一日更換新鮮培養(yǎng)基，凍存液含20％胎牛血清，5％ DMSO，凍存過(guò)程：4℃ 20min，-20℃ 30min，-80℃過(guò)夜后投入液氮長(zhǎng)期保存。

1.2.5 細(xì)胞增殖率的測(cè)定（MTT法）細(xì)胞以1×103/孔接種于96孔板后分別在培養(yǎng)24、48、72、96、120和144h 后進(jìn)行MTT檢測(cè)。每孔加入5mg/mL MTT 20μL，在CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液（注意勿吸出孔板內(nèi)結(jié)晶），然后每孔加入150μL DMSO，室溫下將培養(yǎng)板置于微孔板振蕩器振蕩10min，置于酶聯(lián)檢測(cè)儀于570nm處檢測(cè)各孔吸光度值，以空白孔調(diào)零，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線［3］。

1.2.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 細(xì)胞瘤細(xì)胞生長(zhǎng)匯合率為70％時(shí)收獲細(xì)胞，轉(zhuǎn)入兩個(gè)6 孔板，培養(yǎng)至80％以上匯合時(shí)分成兩組，陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組（脂轉(zhuǎn)pcDNA3.1-PDGFGAL質(zhì)粒轉(zhuǎn)入N-2a細(xì)胞）：6 孔板中隨機(jī)抽取4孔，分別標(biāo)記為第①、②、③和④孔，每孔加完全培養(yǎng)基2mL、含脂質(zhì)體2000 10μL的DMEM培養(yǎng)基250μL、含GAL重組質(zhì)粒4.0μg的DMEM培養(yǎng)基250μL；陰性對(duì)照組（脂轉(zhuǎn)pcDNA3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)入N-2a細(xì)胞）：6 孔板中任選孔分別標(biāo)記為第⑤，⑥，⑦和⑧孔，每孔加完全培養(yǎng)基2mL、含脂質(zhì)體2000 10μL的 DMEM 培養(yǎng)基 250μL、含 PcDNA3.1 質(zhì)粒 4.0μg的DMEM培養(yǎng)基250μL；空白對(duì)照組：6孔板中其余孔分別標(biāo)記為*，每孔加DMEM培養(yǎng)基2.25mL、含Lipofectamine 2000 脂質(zhì)體10μL的DMEM培養(yǎng)基250μL。6孔板置于37℃、5％ CO2、90％濕度條件下脂轉(zhuǎn)4h后更換為完全培養(yǎng)基。

1.2.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平的鑒定 分別在轉(zhuǎn)染后24、48和72h Trizon法提取不同組細(xì)胞總RNA，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)定RNA的濃度為0.48μg/μL，純度為2.0，然后以?xún)?nèi)參GAPDH為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行RT-PCR，25μL的 PCR 反應(yīng)體系包括 cDNA 2μL，10×PCR緩沖液 5μL，10mmol/L 各類(lèi) dNTP 3μL，2.5 U Taq DNA合成酶，GAL及GAPDH正、反向引物各2μL，RNase Free dH2O加至反應(yīng)物總量50μL。輕柔吹吸混勻并短暫離心收集附壁液體后，將樣本置入PCR熱循環(huán)儀，開(kāi)始PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性 30s，64℃退火1min，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)。最后于72℃終延伸，10min。所有的標(biāo)本重復(fù)測(cè)定3次。在擴(kuò)增終點(diǎn)取5μL的產(chǎn)物，進(jìn)行1.2％瓊脂糖凝膠電泳并拍照。凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行條帶光密度掃描，以GAPDH校正做GAL相對(duì)表達(dá)量分析。

1.2.8 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（Enzyme link immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)GAL水平 參照 ELISA試劑盒的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，分別測(cè)定不同時(shí)間段培養(yǎng)上清液GAL表達(dá)水平，ELISA測(cè)定時(shí)同時(shí)設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔，嚴(yán)格參照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作后用酶標(biāo)儀在 450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度（OD值），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出上清液GAL水平，結(jié)果以ng/mL或ng/mg蛋白表示。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 試驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pMDT-PDGF-GAL的鑒定

常規(guī)PCR，電泳鑒定PCR產(chǎn)物與目的片段PDGF-GAL理論大小2 896bp相符（圖1）。與T載體連接后重組質(zhì)粒的酶切鑒定，超螺旋質(zhì)粒大小4000bp左右，單酶切線性化質(zhì)粒在5 500bp左右，與理論值5 588bp相符，雙酶切結(jié)果由于目的片段和T載體骨架大小相似，差100bp左右，雙酶切鑒定結(jié)果不易分辨（圖2）。

圖1 以重組T載體為模板的PCR電泳圖

圖2 重組T載體經(jīng)單酶切和雙酶切后電泳圖

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-PDGF-GAL的鑒定

常規(guī)PCR，電泳鑒定PCR產(chǎn)物與目的片段PDGF-GAL理論大小2 896bp相符；與質(zhì)粒pcDNA3.1骨架連接后重組質(zhì)粒的酶切鑒定，其中環(huán)狀質(zhì)粒大小約為6000bp，重組質(zhì)粒單酶切線性化后理論大小為7 500bp，pcDNA3.1經(jīng)雙酶切后的骨架大小為4 600bp，目的片段PDGF-GAL大小在3000bp左右（圖3）。測(cè)序結(jié)果與理論上的重組片段進(jìn)行比對(duì)，相似性達(dá)到99％。

2.3 N-2a細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制

由圖4可知接種后48h后即圖示第2天細(xì)胞數(shù)明顯比接種后24h時(shí)顯著減少（P＜0.05），又經(jīng)過(guò)一定潛伏適應(yīng)期后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，接種后第6天后細(xì)胞漸趨于生長(zhǎng)穩(wěn)定。另外本試驗(yàn)也曾嘗試6孔板和12孔板等以不同密度接種，無(wú)論臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)或者M(jìn)TT法測(cè)定均顯示接種后48-60h細(xì)胞活力較差，說(shuō)明N-2a細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)環(huán)境的改變較敏感，鑒于N-2a細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)，轉(zhuǎn)染試驗(yàn)適合于在細(xì)胞以一定密度接種后3-5d生長(zhǎng)活力相對(duì)旺盛的時(shí)候進(jìn)行以獲得最佳轉(zhuǎn)染效果。

圖3 重組表達(dá)載體經(jīng)單酶切和雙酶切后電泳圖

圖4 N-2a細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

2.4 脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間段GAL轉(zhuǎn)錄水平的鑒定

轉(zhuǎn)染后48h細(xì)胞中GAL瞬時(shí)表達(dá)量最多，并且凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行條帶光密度掃描（圖5，圖6），以 GAPDH 校正做GAL相對(duì)表達(dá)量統(tǒng)計(jì)分析后與轉(zhuǎn)染后24h和72h GAL的表達(dá)量以及與對(duì)照組GAL表達(dá)量具有顯著差異（P＜0.05），以空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48h細(xì)胞中GAL表達(dá)量與對(duì)照組表達(dá)量沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.1）。

2.5 脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間段GAL表達(dá)水平的鑒定

瞬轉(zhuǎn)后隨著時(shí)間的增長(zhǎng)細(xì)胞上清中GAL表達(dá)量明顯增加，與對(duì)照未轉(zhuǎn)染組上清GAL表達(dá)量具有顯著性差異（P＜0.05），見(jiàn)圖7。

圖5 48h后GAL RT-PCR結(jié)果

圖6 不同時(shí)間GALRT-PCR結(jié)果

圖7 ELISA法測(cè)定瞬轉(zhuǎn)后不同時(shí)間上清中GAL蛋白含量

2.6 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后過(guò)表達(dá)甘丙肽對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響

脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染細(xì)胞后72h后倒置顯微鏡下觀察到有一部分明顯分化趨勢(shì)的細(xì)胞，個(gè)別已近似神經(jīng)元形態(tài)（圖8）。

3 討論

甘丙肽是近幾年來(lái)倍受研究者關(guān)注的一個(gè)基因，其功能是通過(guò)GAL受體GALR1、GALR2、GALR3中的一個(gè)或多個(gè)介導(dǎo)的，由此研究者從甘丙肽與其不同受體及其它物質(zhì)的相互作用著手，深入研究其與各種疾病的聯(lián)系。在阿爾茨海默癥病人腦組織檢測(cè)到過(guò)量的甘丙肽，低于正常水平的α促黑色素細(xì)胞激素，說(shuō)明甘丙肽和α促黑色素細(xì)胞激素參與調(diào)節(jié)記憶過(guò)程［4］，不僅僅在神經(jīng)系統(tǒng)，研究者在皮膚肉芽組織形成過(guò)程中檢測(cè)甘丙肽和甘丙肽受體的表達(dá)，并證實(shí)一些甘丙肽是由成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞所釋放［5］。總而言之，甘丙肽及其相關(guān)蛋白在機(jī)體生理或病理狀態(tài)下的作用是廣泛而復(fù)雜的。

圖8 空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與GAL過(guò)表達(dá)試驗(yàn)組細(xì)胞圖像（10×）

本試驗(yàn)成功構(gòu)建了由神經(jīng)特異性啟動(dòng)子PDGF-β驅(qū)動(dòng)GAL靶向神經(jīng)組織特異性表達(dá)的真核表達(dá)載體pcDNA-PDGF-GAL，測(cè)序正確后脂質(zhì)體法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞N-2a，分別于轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間從轉(zhuǎn)錄水平和表達(dá)水平檢測(cè)GAL的過(guò)表達(dá)情況。轉(zhuǎn)染試驗(yàn)中通過(guò)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線獲得細(xì)胞生長(zhǎng)活力最佳時(shí)期，嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)步驟操作及依照相關(guān)文獻(xiàn)通過(guò)調(diào)節(jié)配制核酸脂質(zhì)體復(fù)合物所用的培養(yǎng)基pH等［6］措施，以攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的真核表達(dá)載體pEGFP-N1進(jìn)行轉(zhuǎn)染預(yù)試驗(yàn)從而獲得轉(zhuǎn)染試驗(yàn)最優(yōu)化參數(shù)，最終實(shí)現(xiàn)GAL在N-2a的過(guò)表達(dá)。

另外，細(xì)胞轉(zhuǎn)染后72h倒置顯微鏡下觀察到有一部分明顯分化趨勢(shì)的細(xì)胞，個(gè)別已近似神經(jīng)元形態(tài)，文獻(xiàn)中曾報(bào)道外源性甘丙肽有促進(jìn)已分化的神經(jīng)干細(xì)胞神經(jīng)突生長(zhǎng)的作用［7］。但是，至于本試驗(yàn)中所觀察到的現(xiàn)象是否說(shuō)明內(nèi)源性甘丙肽過(guò)表達(dá)后會(huì)促進(jìn)N-2a的分化，以及可能的促神經(jīng)突生長(zhǎng)作用有待進(jìn)一步通過(guò)外源甘丙肽干預(yù)N-2a細(xì)胞等試驗(yàn)來(lái)證實(shí)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)成功構(gòu)建了由PDGF-B啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GAL靶向神經(jīng)細(xì)胞特異性表達(dá)的真核表達(dá)載體pcDNAPDGF-GAL，并采用脂質(zhì)體法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染N-2a最終實(shí)現(xiàn)了甘丙肽的過(guò)表達(dá)，為進(jìn)一步穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的獲得及甘丙肽生理病理等功能的研究奠定了一定的試驗(yàn)基礎(chǔ)。

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