趙京禹 費 翔 岳 琦 郭 徽 鄧城旗 郝建華

解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院麻醉科，北京 100037

膿毒癥一般是由于重大外科手術或嚴重燒傷、創(chuàng)傷和缺血再灌注損傷引起的并發(fā)癥，具有極高的發(fā)病率和病死率，是重癥監(jiān)護室（intensive care unit，ICU）患者死亡的首要因素[1-2]。嚴重的膿毒癥可以導致多個器官的功能損傷，臨床表明肺一般最先受到影響導致急性肺損傷（acute lung injury，ALI）[3-4]。 據臨床調查統(tǒng)計，ICU膿毒癥患者一般有大于50%的可能發(fā)生急性肺損傷，其極高的發(fā)病率和病死率是ICU面臨的一個重大難點[5-6]。膿毒癥是由于感染引起的全身炎性反應[7]，雖然現代醫(yī)學技術急速發(fā)展和新型抗生素的不斷運用，但是膿毒癥和其并發(fā)癥并沒有受到有效的遏制[8]，其發(fā)病率高居不下[9]。急性肺損傷是由于肺部不受控制的炎性反應導致急性發(fā)生的進行性呼吸衰竭，目前并沒有有效的治療方法和途徑。因此，探討膿毒癥急性肺損傷的發(fā)病機制和追尋有效的治療藥物和手段是現代醫(yī)學的重要的任務。

蛇床子素（Osthole）是從蛇床子中提取的，具有多種藥理活性，研究表明其對心血管系統(tǒng)、神經系統(tǒng)和內分泌系統(tǒng)相關疾病都具有顯著的療效，同時還具有抑癌的功能[10]。近年來研究發(fā)現，Osthole還具有抑菌消炎的作用，對金黃色葡萄桿菌和綠膿桿菌等有顯著的抑制作用并且能夠增強機體的免疫功能[11-12]。因此，本研究以膿毒癥急性肺損傷大鼠為模型來研究探討Osthole對急性肺損傷的作用效果，旨在為該病的預防和臨床治療提供一種新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 8周齡雄性SD大鼠（SPF級）購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，體重170～230 g，實驗前12 h禁食，不禁水。

1.1.2 主要試劑 蛇床子素（成都曼思特生物科技有限公司）；髓過氧化物酶（MPO）檢測試劑盒，超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒，丙二醛（MDA）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；戊巴比妥鈉（上海化學試劑公司）；二辛可寧酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（上海生工）；IL-6和TNF-α檢測試劑盒（北京四正柏生物科技有限公司）；HRP-IgG （Sigma，USA）；活性caspase-3 抗體和 β-actin 抗體（Santa Cluz，USA）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型構建及分組 動物模型的構建根據文獻報道過的盲腸結扎穿刺術[13]。SD大鼠實驗術前適應生存環(huán)境3 d，采用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。皮膚消毒后，在前腹正中線處切口，辨認并小心取出盲腸，在距離盲端1.5 cm處用絲線結扎，然后用18號針頭在盲腸結扎處遠端穿扎兩次，擠出腸內少許糞便，然后歸位和關腹。術后采用腹腔注射生理鹽水（24 mg/kg）補充體液流失。實驗分組：假手術組（Sham）進行手術但不結扎；急性肺損傷模型組（ALI）盲腸結扎穿刺術處理；低劑量組（ALI+Osthole，100mg/kg）；高劑量組（ALI+Osthole，200 mg/kg）， 術后 2 h腹腔注射，12 h后注射第2次。第2次注射24 h后，麻醉處死大鼠，取材分析。

1.2.2 支氣管肺泡灌洗液的收集 大鼠麻醉處死，開腹取左肺葉采用磷酸鹽緩沖液進行支氣管肺泡灌洗5次（0.5 mL/次），收集灌洗液，12 000 r/min 低溫 4℃離心15 min，小心吸取上清，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 支氣管肺泡灌洗液蛋白含量 蛋白含量的測定按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書操作。在565 nm波長處測定，結果用g/L表示。

1.2.4 肺組織MPO、MDA和SOD的測定 取大鼠肺組織稱重0.1 g左右，漂洗干凈，洗去血液，濾紙擦干，加入勻漿介質進行勻漿。勻漿液10000r/min，離心10min，取上清備用檢測。MPO測定按MPO測定試劑盒說明，樣品孔中加入0.1 mL樣品稀釋液，后加入肺組織勻漿上清液0.02 mL，同時做好空白孔、陰性對照孔、陽性對照孔；封住板孔，37°C放置30 min；反復洗滌板條5次。每個孔中各加入50 μL的酶聯物，封住板孔，37°C放置30 min；反復洗滌板條5次。每個孔內各加入50 μL底物 A、B，封住板孔，37°C 放置 10 min，每個孔內加入終止液50 μL，終止反應。立即取出用分光光度計測定460 nm處OD值。MDA測定：將工作液、緩沖液、沉淀液和40 μL稀釋好的肺勻漿液按順序加進測試管內；對照管中除不加肺勻漿液，余步驟相同；輕輕混勻，分別將試管口用保鮮膜扎緊，用針頭在保鮮膜上扎一個小孔，95℃水浴50 min；流水下冷卻至室溫，加1 mL蒸餾水和5 mL正丁醇吡啶抽提液，漩渦震蕩1 min，532 nm波長處測定OD值。SOD測定：樣品孔中加入0.1 mL樣品稀釋液，加入肺組織勻漿上清液0.02 mL，同時做好空白孔、陰性對照孔、陽性對照孔；封住板孔，37°C放置30 min，洗滌板條5次。每個孔中各加入50 μL的酶聯物，封住板孔，37℃放置30 min；洗滌板條，每個孔內各加入50 μL底物A、B，封住板孔，37℃放置 10 min，加入終止液 50 μL，終止反應，500 nm波長處測定OD值。

1.2.5 支氣管肺泡灌洗液細胞因子水平測定 提前30 min從取出冰箱中試劑盒，溫度下降到室溫；濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋（0.05%）；凍干標準品用其稀釋液1 mL徹底溶解混勻，放置15 min。制備梯度濃度的標準品：從冰箱中取支氣管肺泡灌洗液（BAL）上清，自然升溫至室溫。根據先前預實驗的情況稀釋成合適的濃度；濃縮的生物素抗體以及酶結合物均用其相應的稀釋液進行稀釋，分別在臨用前15 min配好。將準備好的待測樣品和標準樣品分別加入各反應孔中（0.1 mL/孔）。37℃孵育 90 min，洗滌 5 次。加入生物素化抗體（0.1 mL/孔），暗處 37℃孵育 30 min，洗滌5次。每孔加顯色劑 0.1 mL，37℃，15 min，避光顯色。加入100 μL終止液，終止顯色，450 nm測量OD值。

1.2.6 Western blot方法 提取肺組織蛋白，BCA法測蛋白的濃度。取蛋白樣品30 μg，進行SDSPAGE電泳。電泳結束后，將凝膠上的蛋白通過點轉移轉移到硝酸纖維素膜上，并用1%麗春紅染色檢測轉移效果。而后，將膜放在10 mL封閉液中（2%脫脂奶粉，TBS （Tris-buffered saline，150 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl，pH=7.5 配制）1 h； 加入一抗 （1∶1000），4℃過夜孵育；TBST（TBS 含 0.02%Tween）洗 3次，加入二抗 HRP-IgG（1∶10000）室溫孵育 2 h；TBST洗膜3次，TBS洗膜1次，暗處發(fā)色。發(fā)色液現用現配（1 mL 4-氯-1-萘酚（6 mg/mL 甲醇配制），9 mL TBS，6 μL H2O2）。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0對實驗數據進行分析，計量資料數據以均數±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 蛇床子素對BAL蛋白總量的影響

結果顯示，ALI 組蛋白總量 [（0.48±0.04）g/L]與Sham組相比急劇增加（P＜0.01），當用蛇床子素處理后，BAL蛋白含量顯著降低（P＜0.05），而高劑量的蛇床子素（200 mg/kg）[（0.26±0.02）g/L]比低劑量的蛇床子素 （100 mg/kg）[（0.33±0.03）g/L]效果更加明顯（P ＜ 0.05）。 見圖 1。

圖1 蛇床子素對BAL蛋白總量的影響

2.2 蛇床子素對MPO、SOD和MDA水平的影響

結果顯示，ALI組中SOD的水平顯著下降，而MDA和MPO的水平則顯著升高（P＜0.05），說明氧化應激反應在ALI中顯著增加，當用蛇床子素處理后，這些異常變化則被顯著抑制。見表1。

表1 蛇床子素對氧化應激反應的影響（±s）

表1 蛇床子素對氧化應激反應的影響（±s）

注：與 Sham 組比較，*P＜0.05；與 ALI組比較，#P＜0.05；Sham 組：假手術組；ALI：急性肺損傷模型組；ALI+Osthole：蛇床子素處理的急性肺損傷模型組；MPO：髓過氧化物酶；SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛

Sham組ALI組ALI+Osthole組（200mg/kg）ALI+Osthole組（100mg/kg）22.934±3.257 9.657±1.237*14.679±1.035#17.639±1.893#5.634±0.860 15.568±2.987*9.345±1.979#11.336±1.236#7.534±1.812 15.651±1.137*10.884±1.811#9.012±0.896#組別 SOD（U/mg protein）MDA（nmol/mg protein）MPO（U/g wet tissues）

2.3 蛇床子素對細胞因子水平的影響

結果顯示，與Sham組相比ALI組中IL-6水平明顯升高（P＜0.05），當用蛇床子素處理時，IL-6水平明顯降低（P＜0.05），而TNF-α的水平變化也是相同的趨勢（P＜0.05），表明蛇床子素可以通過調控促炎因子的水平來抑制炎性反應。見圖2。

圖2 蛇床子素對IL-6和TNF-α水平的影響

2.4 蛇床子素對細胞凋亡的影響

結果顯示，急性肺損傷導致活性caspase-3的水平急劇增加，而當蛇床子素處理后，活性caspase-3的水平顯著下降，表明蛇床子素對肺組織細胞凋亡具有調控作用。見圖3。

圖3 蛇床子素對活性caspase-3水平的影響

3 討論

膿毒癥是重ICU患者死亡的最首要的原因，常常導致各器官的損傷，特別是肺最先受到損傷，膿毒癥相關的急性肺損傷也是ICU發(fā)病率和致死率最高的一種臨床疾病[14-16]。急性肺損傷通常由于全身炎性反應失控，導致劇烈的炎性反應，釋放大量的炎癥因子和介質作用損傷肺泡上皮細胞和微血管內皮細胞，引起血管內蛋白質大量滲出，產生肺泡性水腫和間質性肺水腫，最終引起急性呼吸衰竭[17-18]。如何防治和治療膿毒癥相關的急性肺損傷，降低其發(fā)病率和病死率，是現代醫(yī)學的所面臨的難點。中藥具有毒性低、安全高、藥源充足等特點，因此在治療膿毒癥相關的急性肺損傷中具有潛在的前景。Osthole是從中草藥蛇床子中提取的一種成分，其全名為7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素。近年來國內外研究學者都對Osthole的藥理活性做了廣泛的研究，發(fā)現其具有抗氧化、抗癌、抗毒、抗菌和抗炎等多種藥效功能。本研究以大鼠為模型，主要探討了Osthole對急性肺損傷的保護相應及其作用的初步機制。

急性肺損傷主要病理變化是肺泡上皮細胞和肺泡微血管通透性顯著增高，肺的炎癥損傷通常會導致肺泡上皮細胞功能受損，肺泡內的蛋白質滲出，對呼吸功能造成嚴重的障礙，導致蛋白質的大量外滲。針對肺泡上皮細胞通透性的研究也是當前的熱點。有報道稱阻斷熱休克蛋白HSP90的表達，可以顯著降低肺泡上皮細胞和微細胞內皮細胞的通透性提高膿毒癥大鼠模型的生存率[19-20]。Rac-1的活化可以穩(wěn)定血管的內皮細胞，降低血管的通透性，對膿毒癥大鼠具有顯著的保護效應。本實驗也表明蛇床子素可以降低急性肺損傷引起的BAL蛋白含量升高的異常變化，對細胞通透性的改善具有顯著的效果。為了探究蛇床子素是否對肺泡蛋白質滲出的作用，本研究檢測了各實驗組BAL蛋白含量的變化情況。結果發(fā)現，急性肺損傷組蛋白總量與對照組相比急劇增加 （P＜0.01），當用蛇床子素處理后，BAL蛋白含量顯著降低 （P＜0.05），而高劑量的蛇床子素（200 mg/kg）比低劑量的蛇床子素（100 mg/kg）效果更加明顯（P ＜ 0.05）。

細菌感染通常會引起中性粒細胞的浸潤和活化，釋放大量炎癥介質，導致氧化應激反應?；钚匝醯倪^量積累導致基因突變和蛋白生活，對細胞功能和機體都造成極大的損害，造成嚴重的病理結果[21]。急性肺損傷中的氧化應激反應已有大量報道，活性氧的過量積累也是造成肺細胞通透性改變的主要原因[22]。MPO是中性粒細胞的重要標志物，也是重要的過氧化物酶類，其水平與中性粒細胞的活化強度密切相關。因此，通過測定MPO的水平可以反映中性粒細胞的活化和浸潤程度。中性粒細胞和相關炎癥細胞的活化和浸潤，釋放大量的促炎癥因子例如IL-6和TNF-α，促炎因子通常經過信號通路的轉導使炎性反應級聯放大，不但加重肺損傷，而且損傷免疫系統(tǒng)[23]。IL-6和TNF-α是許多炎性反應中重要的兩種促炎癥細胞因子，為了探討Osthole對促炎因子的影響，本研究檢測了BAL中這兩種細胞因子水平的變化。氧化應激反應是ALI的重要病理變化，過量的活性氧（ROS）通常會導致基因突變和蛋白。大量中性粒細胞的浸潤引起呼吸爆炸，會產生過多的過氧化物。為了探討Osthole對ALI中氧化應激反應的影響，本研究檢測了大鼠肺組織中SOD，脂質氧化產物MDA以及中性粒細胞分泌的標志物MPO。結果發(fā)現，Osthole可以顯著抑制急性肺損傷引起MPO水平升高，即可以抑制中性粒細胞的活化和浸潤，從而可以緩解炎性反應和氧化應激反應?？寡趸瘎┛梢酝ㄟ^清除體內的氧自由基來抑制膿毒性引起的炎性反應[24]，而SOD是體內唯一可以清除氧自由基和過氧化物的抗氧化酶，其活性水平是機體抗氧化能力的主要標志。MDA是體內脂質過氧化反應的產物，其水平主要反映體內細胞受到氧自由基攻擊的程度[25]。本試驗中，還發(fā)現在急性肺損傷模型中，SOD水平顯著下降，而MDA水平明顯升高，表明急性肺損傷引起氧化應激反應，機體的抗氧化能力下降。本結果表明Osthole可以有效的抑制氧化應激反應，提高機體的抗氧化能力。

據報道，綠膿桿菌引起的肺部感染導致內皮細胞的凋亡，是肺部細胞通透性改變的重要原因[26]，肺炎癥損傷也涉及到細胞凋亡[14]，為了進一步探討Osthole是否對細胞凋亡也有調控作用，本研究檢測了肺組織中活性caspase-3的水平變化，結果發(fā)現急性肺損傷中肺部組織活性caspase-3的水平明顯升高，表明急性肺損傷中細胞凋亡途徑被活化[27-30]。Osthole可以抑制活性caspase-3的水平，表明Osthole可以通過調控細胞凋亡來改善急性肺損傷。

綜上所述，本研究以急性肺損傷大鼠為模型，探討研究Osthole對其作用效果。結果發(fā)現Osthole可以抑制炎性反應，緩解肺組織的氧化應激反應，降低肺部細胞的凋亡，從而減輕肺組織的損傷和通透性的變化，對急性肺損傷大鼠有顯著的保護效應。因此，Osthole對急性肺損傷的作用值得進一步的研究，其作用機制也有待深入的探討。

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