尉杰忠,李艷花,劉春云,楊德兵,孟 健,王力軍,肖保國,馬存根*

（1.山西大同大學腦科學研究所，山西 大同 037009；2.山西大同大學附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山西 大同 037009；

3.復旦大學神經(jīng)病學研究所，上海200040）

Rock抑制劑-Fasudil對EAE外周免疫的調(diào)節(jié)作用

尉杰忠1,李艷花1,劉春云1,楊德兵1,孟 健1,王力軍2,肖保國3,馬存根1*

（1.山西大同大學腦科學研究所，山西 大同 037009；2.山西大同大學附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山西 大同 037009；

3.復旦大學神經(jīng)病學研究所，上海200040）

目的探討Rock抑制劑Fasudil對實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）發(fā)病起始環(huán)節(jié)的外周免疫調(diào)節(jié)機制。方法將雌性C57BL／6小鼠分為CFA組、EAE組和Fasudil組。Fasudil組動物免疫后第7 d腹腔給予Fasudil（50 mg／kg·d），連續(xù)給藥14 d。免疫后隔天觀察各組小鼠臨床評分和體質量變化。在免疫后28 d處死動物，取脊髓進行HE染色和髓鞘染色，制備脾臟單個核淋巴細胞（MNC），測定細胞增殖和細胞因子IL-4，IL-10，IL-1β，IFN-γ的含量，流式細胞術觀察CD4，CD25調(diào)節(jié)性T細胞的比例，部分脾臟組織和MNC涂片行免疫組化熒光染色觀察Rock的表達。結果Fasudil在EAE外周免疫組織和細胞通過下調(diào)Rock的表達，抑制Rock的激活，明顯改善EAE的臨床癥狀評分（P＜0.05）；減輕EAE外周炎性細胞向中樞的浸潤，緩解神經(jīng)髓鞘的脫失；經(jīng)Fasudil干預可以下調(diào)EAE外周特異性MOG35-55反應性T淋巴細胞增殖能力，下調(diào)炎性細胞因子IFN-γ和IL-1β水平，升高保護性細胞因子IL-10水平，促進CD4，CD25調(diào)節(jié)性T細胞比例增加。結論Rho／Rock信號通路的激活在EAE的發(fā)病中起著重要作用，應用Rock抑制劑--Fasudil抑制EAE免疫病理過程中外周免疫細胞激活這一起始重要環(huán)節(jié)，減少炎性細胞的中樞浸潤，緩解EAE的臨床癥狀。

多發(fā)性硬化；實驗性自身免疫性腦脊髓炎；Rho激酶；鹽酸法舒的爾

目前認為多發(fā)性硬化（multiple sclerosis,MS）是由CD4＋Th1細胞介導的以細胞免疫反應為主的自身免疫性疾病。應用髓鞘堿性蛋白免疫易感小鼠,可構建MS的實驗動物模型即實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE）[1-2]。EAE的整個過程中,外周免疫細胞活化（主要包括CD4＋Th1、CD4＋Th17激活）是免疫反應的起始關鍵環(huán)節(jié),外周免疫細胞活化的數(shù)量及程度決定其能否進一步突破血-腦屏障向中樞移行和浸潤。因此有效調(diào)控外周免疫細胞發(fā)生的免疫應答,抑制免疫病理過程中外周免疫細胞激活這一起始重要環(huán)節(jié),可阻遏這種起源于外周而向中樞發(fā)展和破壞的自身免疫反應的序貫性發(fā)生。

Rho/Rho激酶（Rock）信號途徑是機體中重要的信號轉導通路,現(xiàn)已證實包括MS和EAE在內(nèi)的多種神經(jīng)系統(tǒng)病理狀態(tài)下均可出現(xiàn)Rock的激活和表達[3-4]。應用Rock抑制劑（如Y-27632）在免疫炎癥疾?。ㄈ缒X缺血、脊髓損傷、炎性脫髓鞘、Alzheimer＇s病、神經(jīng)疼痛等疾?。┠苡行p少外周活化淋巴細胞的增殖,從而降低外周免疫活化細胞向中樞的侵襲[5-6]。另有研究應用Rock抑制劑Fasudil（鹽酸法舒地爾）對EAE也有很好的治療效果,不僅使外周免疫活化的淋巴細胞減少,而且使導致EAE發(fā)生的重要細胞因子IL-17和IFN-γ水平下降[7]。

本研究以EAE為研究對象,觀察Rock在其外周免疫組織的激活及應用Rock抑制劑Fasudil治療后的外周免疫細胞激活和表達情況,探討Rho/Rock信號途徑在CNS脫髓鞘性自身免疫性疾病發(fā)病起始關鍵環(huán)節(jié)的免疫調(diào)節(jié)機制和初步應用。

1 材料和方法

1.1 材料

雌性C57BL/6小鼠,體質量18～20 g,購自北京維通利華實驗動物中心（動物實驗遵照山西大同大學生物醫(yī)學研究倫理審查委員會制定的實驗動物倫理原則執(zhí)行科學實驗）。髓鞘少突膠質細胞糖蛋白35-55多肽（myelin oligodendrocyte glycoprotein peptides 35-55,MOG35-55）由西安聯(lián)美生物科技有限公司合成;完全弗氏佐劑購自Sigma公司;百日咳毒素（PTX）購自Alexis公司;結核分枝桿菌H37Ra （TB）購自BD公司;小鼠Rock單克隆抗體購自BD公司;FITC標記的羊抗小鼠二抗購自Santa Cruz公司;鹽酸法舒地爾注射液（Fasudil）由天津紅日藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組

C57BL/6小鼠按體質量平均分為3組（各組平均體質量相同）,即佐劑（CFA）組,EAE組和Fasudil組,每組各10只。

1.2.2 模型制備和給藥

用生理鹽水溶解配制MOG35-55,加用TB和完全弗氏佐劑,使油劑和水劑體積比為1∶1。用注射器反復推抽形成抗原乳劑。EAE組和Fasudil組小鼠按0.1 mL/只于背部皮下4個點分別注射抗原乳劑（MOG35-55濃度為250μg/只,TB濃度為350μg/只）,CFA組以生理鹽水代替MOG35-55同法配制成乳劑,作為對照組等量注射。免疫當天和48 d后腹腔分別注射PTX 750 ng/只,用以增強免疫反應。Fasudil組于免疫后第7 d腹腔注射Fasudil注射液（50 mg/kg·d）,連續(xù)給藥2周。EAE組和CFA組以等量生理鹽水腹腔注射作為對照。

1.2.3 臨床觀察

動物免疫后隔日評定并記錄各組小鼠體質量和臨床癥狀評分,盲法進行。動物臨床癥狀評分標準按照國際通用的5分法進行評定,癥狀介于兩者標準之間者按±0.5分計算[8]。

1.2.4 組織取材

免疫后第28 d,各組小鼠用3％戊巴比妥腹腔注射麻醉,無菌取脾臟,放置于預冷的0.01 mol/L PBS備存;用0.01 mol/L PBS心臟灌流,4％多聚甲醛繼續(xù)灌流內(nèi)固定,分離脊髓。取脊髓頸、腰膨大和部分脾臟組織,用OCT在液氮中包埋,后期以10μm厚度做冰凍連續(xù)切片,脊髓標本常規(guī)HE染色、髓鞘染色,脾臟組織標本行Rock免疫組化染色。

1.2.5 分離純化脾臟單個核細胞進行增殖反應和細胞因子檢測

取脾臟置于預冷的DMEM培養(yǎng)液中,研磨沖洗,過尼龍濾網(wǎng)。無菌雙蒸水溶破紅細胞后加2.7％ NaCl恢復等滲,制成單細胞懸液。過尼龍棉柱,洗脫液離心棄上清,重懸于完全培養(yǎng)液,得到脾臟單個核細胞。取部分脾臟單個核細胞調(diào)整細胞終濃度為2×106/mL,按250μL/孔加入96孔細胞培養(yǎng)板;體外分別經(jīng)MOG35-55特異性抗原刺激和MBP68-86對照抗原刺激。一份標本培養(yǎng)48 d后加入[3H]-TdR至終濃度1 Ci/mL,繼續(xù)培養(yǎng)24 d,βcounter測量放射性強度;另一份標本收集上清液,按照ELISA檢測試劑盒的說明操作,分別檢測IL-4,IL-10,IL-1β和IFN-γ的含量。

1.2.6 FACS檢測外周調(diào)節(jié)性T細胞

每組分別取300 L濃度為1×106/mL的脾臟單個核細胞,經(jīng)PBS洗滌、熒光素標記抗體FITC anti-mouse CD4和PE anti-mouse CD25標記,將細胞重懸為單細胞懸液,流式細胞儀檢測CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細胞。

1.2.7 脾臟組織和脾臟單個核細胞涂片免疫觀察

脾臟冰凍切片室溫干燥,經(jīng)PBS洗滌、1％BSA室溫封閉1 h后,加抗小鼠Rock單克隆抗體（1∶500）置4℃過夜。次日PBS洗滌、熒光素二抗（1∶1000）標記、室溫孵育2 h,PBS再洗,最后50％甘油封片熒光顯微鏡鏡檢。另外每組取脾臟單個核細胞的細胞懸液10 L,滴于載玻片上,室溫自然干燥,-20℃?zhèn)浯?同法行細胞免疫組化觀察。

1.2.8 統(tǒng)計學處理

計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差來表示,采用SPSS13.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析,組間臨床癥狀評分采用軼和檢驗,其余組間比較采用單因素方差分析,發(fā)病率的比較采用χ2檢驗,取α=0.05作為檢驗水準。

2 結果

2.1 臨床癥狀

EAE組小鼠在免疫后第12 d開始發(fā)病,早期癥狀主要表現(xiàn)有進食減少、體質量下降、皮毛不光滑,易激惹。在免疫后第16～18 d癥狀達到高峰,表現(xiàn)為尾部無力下垂,隨病情加重可出現(xiàn)后肢癱瘓或不能自主翻身,嚴重者伴有四肢癱瘓,最高評分達到3.5分。與EAE組相比,Fasudil組小鼠體質量輕度下降,發(fā)病率較低,起病較晚,平均臨床癥狀評分較低（P＜0.05）。CFA組未出現(xiàn)臨床癥狀,體質量持續(xù)增加。各組動物發(fā)病情況比較見表1,臨床癥狀評分變化見圖1,體質量變化見圖2。

表1 CFA，EAE，F(xiàn)asudil組發(fā)病情況比較

圖1 EAE組、Fasudil組、CFA組體變化

圖2 EAE組、Fasudil組臨床癥狀評分

2.2 脊髓病理變化

脊髓HE染色（圖3-A,B,C）可見EAE組有明顯的大量炎性細胞（以淋巴細胞和單核細胞為主）浸潤,病灶主要分布在灰質和白質交界區(qū)及匯管區(qū)。Fasudil組炎性浸潤程度明顯少于EAE組,CFA組未見異常變化。脊髓髓鞘染色（圖3-D,E,F）可見EAE組發(fā)生明顯的髓鞘脫失,表現(xiàn)為神經(jīng)髓鞘稀疏不連續(xù),Fasudil組髓鞘脫失較EAE組減輕,CFA組未見異常變化。結合臨床癥狀和病理變化,提示本研究EAE模型制備成功,Fasudil干預后能夠明顯減輕EAE外周炎性細胞向中樞的浸潤,緩解神經(jīng)髓鞘的脫失。

圖3 各組脊髓HE染色和髓鞘染色

2.3 脾臟單個核細胞增殖測定

以[3H]摻入法測定各組脾臟單個核細胞分別經(jīng)MOG35-55特異性抗原刺激和MBP68-86對照抗原刺激增殖反應,結果顯示（圖4）：在EAE組經(jīng)MOG35-55刺激后脾臟單個核細胞增殖反應,比經(jīng)MBP68-86刺激后明顯增加（P＜0.05）;經(jīng)MOG35-55刺激后,EAE組脾臟單個核細胞增殖反應比CFA組顯著增加（★：P＜0.01）,而Fasudil組增殖反應明顯低于EAE組（★： P＜0.01）。結果提示：MOG35-55特異性抗原是導致EAE發(fā)生外周免疫活性細胞增殖反應的主要物質;經(jīng)Fasudil干預可以下調(diào)EAE外周特異性MOG反應性T淋巴細胞增殖能力。

圖4 各組脾臟單個核細胞體外培養(yǎng)殖測定

2.4 脾臟單個核細胞細胞因子測定

以ELISA法分別測定各組脾臟單個核細胞分別經(jīng)MOG35-55特異性抗原刺激后細胞因子的變化。結果顯示：經(jīng)MOG特異性抗原刺激后,代表炎性細胞因子的IFN-γ和IL-1β水平,在Fasudil組明顯較EAE組下降（圖5-A,B,★：P＜0.05）。代表保護性細胞因子的IL-10水平,在Fasudil組明顯較EAE組升高（圖5-C,★：P＜0.05）,另一保護性細胞因子IL-4在Fasudil組和EAE組之間無明顯差別（圖5-D）。

圖5 各組脾臟單個核細胞因子測定

2.5 FACS對脾臟單個核細胞中CD4CD25調(diào)節(jié)

性T細胞的檢測

外周免疫細胞中,調(diào)節(jié)性T細胞是一類具有免疫抑制作用的T細胞,約占外周CD4＋T細胞的5～ 10％。該類細胞以“主動”的方式參與免疫應答或免疫耐受調(diào)節(jié)。在EAE免疫病理過程,特別是在外周免疫細胞激活這一重要起始環(huán)節(jié)中,CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細胞具有重要的免疫抑制和免疫調(diào)節(jié)作用。流式細胞測試結果顯示：CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細胞百分率在CFA組占0.84％,EAE組占0.8％,Fasudil組占1.35％（與EAE＋組比較P＜0.05）。結果提示： Fasudil可以促進CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細胞比例增加,進而抑制外周免疫細胞激活。

2.6 脾臟組織Rock的表達

將各組脾臟組織的冰凍切片用間接免疫熒光染色的方法檢測Rock的表達。熒光顯微鏡下觀察到：在脾小結及周圍有Rock的陽性表達,呈綠色熒光。EAE組Rock陽性的表達明顯較CFA組增多（圖6-A,B）,提示EAE發(fā)生時主要的外周免疫組織--脾臟有Rock的激活和表達增加。而Fasudil組Rock陽性的表達明顯比EAE組減少（圖6-B,C）,提示經(jīng)Fasudil干預EAE后,在外周免疫組織和細胞中可以明顯下調(diào)Rock的表達,抑制Rock的激活。

圖6 各組脾臟組織ROCK的表達（免疫熒光染色）×200

3 討論

在EAE的免疫病理過程中,外周自身反應性T淋巴細胞（TLC）激活和活化免疫炎性細胞的中樞浸潤是其重要的病理免疫事件。多數(shù)研究已證實： EAE的發(fā)病是一種起源于外周的免疫應答,繼而有活化的外周免疫細胞侵入CNS并在局部擴增,在CNS產(chǎn)生病灶,引發(fā)相應的臨床癥狀[9]。因此通過抑制EAE發(fā)病的源頭,即通過加強外周免疫細胞有益的免疫調(diào)節(jié),抑制外周免疫細胞的病理免疫應答,使產(chǎn)生外周免疫活化細胞減少,繼而影響后續(xù)外周免疫活化細胞向CNS浸潤的數(shù)量和程度,可改善EAE的臨床癥狀。

Rho/Rock信號通路隨多種炎癥介質和細胞因子的刺激而激活,通過激酶級聯(lián)反應介導和調(diào)控細胞的增殖、分化、移行等,是細胞行為改變最直接的信號分子。通過應用Rock抑制劑可以調(diào)控外周免疫細胞,抑制免疫應答的發(fā)生。應用Rock抑制劑Fasudil可以延緩EAE的病理免疫過程,改善EAE的臨床癥狀[10-11]。由于Rock激活是T淋巴細胞活化和遷移所必需的條件,使用Fasudil更好地抑制外周免疫細胞活化和增殖,有效阻止向CNS的移行,而且在EAE早期（外周免疫應答初期）應用有更好的干預效果[12]。本研究應用Rock抑制劑--Fasudil在EAE早期（免疫后第7 d）給予干預治療,結果證實Fasudil明顯使EAE的發(fā)病率下降70％,平均高峰期臨床癥狀評分下降,有效緩解EAE的發(fā)病和臨床癥狀。病理結果也表明,Fasudil明顯減輕EAE外周炎性細胞向CNS的浸潤。

脾臟組織中單個核淋巴細胞（MNC）是EAE外周主要的免疫應答細胞,因此對脾臟的調(diào)控成為改善EAE臨床癥狀的可能干預機制之一。本研究以脾臟MNC為研究對象,通過體外培養(yǎng)和特異性抗原再刺激后,分別檢測了各組脾臟MNC的增殖和細胞因子表達。同時分別觀察了脾臟組織和MNC中Rock的表達。結果證實：經(jīng)Fasudil干預后的EAE,在上述外周免疫組織和免疫細胞中Rock的表達明顯減少;Fasudil明顯下調(diào)EAE外周特異性淋巴細胞的增殖能力,并且抑制這些外周免疫細胞分泌的相關炎性細胞因子IFN-γ和IL-1β水平,促進抑炎細胞因子IL-10的增加。Fasudil減低了外周特異性淋巴細胞的活化程度和數(shù)量,CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細胞為一類具有免疫調(diào)節(jié)功能的T細胞亞群,經(jīng)TCR介導的信號刺激活化以后發(fā)揮抗原非特異性抑制效應,對CD8＋的活化和增殖均有抑制作用,限制特異性抗原誘導的免疫應答過度所致的免疫損傷,避免EAE等自身免疫疾病的產(chǎn)生,對維持機體免疫動態(tài)平衡具有至關重要的作用[13-14]。本研究應用流式細胞術觀察了外周脾臟MNC中CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細胞的比例。研究初步證實：Fasudil可以促進CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細胞比例增加,通過CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細胞抑制外周免疫細胞（主要是CD4＋T細胞）發(fā)生免疫應答,減少免疫細胞活化的數(shù)量及程度。這可能是Fasudil有效干預EAE的外周免疫的另一機制。

綜上所述,我們的研究結果表明Rho/Rock信號通路的激活在EAE的發(fā)病中起著重要作用,應用Rock抑制劑--Fasudil通過下調(diào)EAE外周免疫組織和細胞中Rock的表達,使外周特異性淋巴細胞的增殖能力降低,抑制相關炎性細胞因子IFN-γ和IL-1β水平,促進抑炎細胞因子IL-10的增加,促進CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細胞比例增加,最終有效調(diào)控外周免疫細胞的活化,抑制EAE免疫病理過程中外周免疫細胞激活這一起始重要環(huán)節(jié),減少炎性細胞的CNS浸潤,阻止后序發(fā)生于CNS的自身免疫反應的進一步發(fā)展。本研究可能為今后臨床應用Rock抑制劑治療MS提供實驗依據(jù)。

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〔責任編輯 楊德兵〕

The Immunoloregulation of Fasudil,a Rho Kinase Inhibitor,in the P eripheral Immune System of Experimental Autoimmune Encephalom yelitis

Y U Jie-zhong1,L I Yan-hua1,L IU C h un-yun1,Y ANG De-bing1,MENG Jian1,
W ANG L i-jun2,X IAO Biao-guo3,MA Cun-gen
（1.Institute of Brain Science,ShanxiDatong University,Datong Shanxi，037009;
2.Departmentof Neurology,the A ffiliated H ospital of ShanxiDatong University,Datong Shanxi，037009;
3.Institutes of Brain Science and State Key Laboratory of Medical Neurobiology,Fudan University,Shanghai,200040）

Objective To further explor the mechanism（s）of immunoloregulation underlying the amelioration in EAE caused by Fasudil,particularly focusing on anti-inflammatory effect in the peripheral immune system.Methods Female C57BL/6 mice immunized with MOG35-55 were randomly divided into CFA group,EAE group and Fasudil group.Fasudil was intraperitoneally injected in the dosage of 50 mg·kg·d on day 7 post-immunization（p.i.）for 14 consecutive days.Clinical signs were evaluated and body weightwas recorded every other day.Mice were sacrificed on day 28 p.i.,and the pathological changes in spinal cordswere detected by HE staining and demyelination staining.Spleenmononuclear cell（MNC）were isolated under asepsis.The proliferation assay and CD4 CD25 Treg proportion were determined,and the supernatantswere harvested for the detection of IL-4、IL-10、

IL-1β、IFN-γ.The expression of Rock in spleen and MNC was detected by immunofluorescence staining.Results： Fasudil hydrochloridemay significant ameliorate symptoms of EAE,lessen inflammatory cell infiltration and demyelination,suppress the secretion of IFN-γ,IL-1βand promote the secretion of IL-10,the proportion of CD4 CD25 Treg.The expression of Rock in spleen and MNC was significantly upregulated in EAE.Conclusions：Fasudil,Rock inhibitor,ameliorates disease progression in EAE, acting possibly through anti-inflammatory and immunoloregulation pathway in the peripheral immune system.

m ultiple sclerosis;e xperimental autoimmune encephalomyelitis;r ock;f asudil

R744.5＋.1

A

2012-09-22

國家自然科學基金2012年面上項目［81272163］；國家自然科學基金2010年面上項目［81070957］；山西大同大學青年科學研究基金項目［2010Q6］

作者簡介：尉杰忠（1975-），男，山西陽高人，碩士，講師，研究方向：神經(jīng)免疫學；*馬存根，男，博士，教授，博士生導師，通信作者。

1674-0874（2013）01-0055-03