歐陽天贄，袁 泉

武漢理工大學(xué)理學(xué)院化學(xué)系，武漢 430070

細(xì)辛為我國(guó)傳統(tǒng)中藥，最早可見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有鎮(zhèn)痛、抗炎［1］、抑菌［2］等功效。研究表明，細(xì)辛中含有約幾十種化學(xué)成分，其中甲基丁香酚的含量最高［3-5］，是多種植物揮發(fā)油的化學(xué)成分之一［6］。主要作為調(diào)味品用于多種食品中［7］。還可用于化妝品、肥皂、洗發(fā)劑、香水中［8］。研究表明甲基丁香酚具有抗過敏、抗組胺、麻醉、降血壓、抗抑郁、鎮(zhèn)咳、鎮(zhèn)痛等多種藥理活性［9-11］。

目前對(duì)細(xì)辛揮發(fā)油中甲基丁香酚的研究多集中于定量分析［12-14］，提取方法多采用傳統(tǒng)提取法，超聲輔助提取法(ultrasonic assisted extraction，UAE)的運(yùn)用可提高細(xì)辛揮發(fā)油的提取效率［15］。本實(shí)驗(yàn)通過研究超聲輔助提取過程中料液比、浸泡時(shí)間、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)甲基丁香酚得率的影響，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，建立L9(34)正交試驗(yàn)，優(yōu)化超聲輔助提取華細(xì)辛揮發(fā)油中甲基丁香酚的工藝條件，為華細(xì)辛的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

細(xì)辛購(gòu)于湖北省武漢市藥材市場(chǎng)(產(chǎn)地:湖北恩施)，經(jīng)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院張宏宇教授鑒定為華細(xì)辛(Asarum sieboldii Miq.)的干燥根莖。樣品經(jīng)粉碎后密封保存待用;甲基丁香酚標(biāo)準(zhǔn)品為美國(guó)Accustandard公司;其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

KQ5200E超聲波儀(昆山市超聲儀器有限公司);Agilent 6890N氣相色譜儀(美國(guó));FA2204B型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 GC 分析條件

色譜柱:安捷倫DB-35MS毛細(xì)管色譜柱(30 m× 0.32 mm × 0.25 μm);升溫程序:初始溫度 100℃，保持1 min，以20℃/min升到160℃，5℃/min升到190℃，20℃/min升到220℃保持5 min;進(jìn)樣口溫度:220 ℃;檢測(cè)器:250 ℃;進(jìn)樣量:0.5 μL。分流比:10∶1。

1.2.2 精密度考察實(shí)驗(yàn)

取8批樣品，每批樣品測(cè)定兩次甲基丁香酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，通過絕對(duì)極差和相對(duì)極差推算出測(cè)定相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，判斷儀器的精密度。

1.2.3 回收率試驗(yàn)

提取樣品中加入一定量的甲基丁香酚的正辛醇標(biāo)準(zhǔn)溶液后，測(cè)得甲基丁香酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計(jì)算加入標(biāo)準(zhǔn)溶液后的甲基丁香酚質(zhì)量百分?jǐn)?shù)理論值，由此計(jì)算得到甲基丁香酚的回收率。

回收率=(加標(biāo)試樣測(cè)定值-試樣測(cè)定值)÷加標(biāo)量×100%

1.2.4 甲基丁香酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

電子天平上去皮后準(zhǔn)確稱取甲基丁香酚標(biāo)準(zhǔn)品0.0131 g，用移液管加甲醇定量至 1.8040 g，搖勻得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.3%的甲基丁香酚標(biāo)準(zhǔn)溶液。

正辛醇甲醇溶液的配制:取1.67 mL正辛醇和18.33 mL甲醇溶液混合而成20 mL體積分?jǐn)?shù)為8.4%的正辛醇甲醇溶液。

分別取上述甲基丁香酚標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.0686、0.1452、0.2754、1.0000 g，分別用甲醇定量至1.0000 g，配制成甲基丁香酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.05、0.10、0.20、0.73% 的梯度溶液，分別加入 20 μL 體積分?jǐn)?shù)為8.4%的正辛醇甲醇溶液，按實(shí)驗(yàn)設(shè)定的方法分別進(jìn)行GC測(cè)定，以甲基丁香酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)甲基丁香酚與正辛醇的峰面積比進(jìn)行線性回歸分析，得回歸方程為Y=6.446X+0.0229(Y是甲基丁香酚與正辛醇的峰面積比，X是甲基丁香酚質(zhì)量分?jǐn)?shù))，R2=0.9997，對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.05 ～0.73%范圍內(nèi)與峰面積比有良好的線性關(guān)系。

1.2.5 甲基丁香酚的提取

準(zhǔn)確稱取1.0 g細(xì)辛根粉末，置于100 mL錐瓶中，按料液比1∶40加入甲醇溶液，超聲提取15 min，過濾。濾渣以相同的條件再提取一次，過濾后合并濾液，水浴40℃條件下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干甲醇溶液后，40℃真空干燥1 h，用1.00 g甲醇溶解，準(zhǔn)確加入20 μL前述配制正辛醇甲醇溶液，微孔濾膜過濾，氣相色譜分析，選取正辛醇作為內(nèi)標(biāo)物內(nèi)標(biāo)法定量。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出提取物中甲基丁香酚的質(zhì)量，按下面方法計(jì)算甲基丁香酚的得率:

甲基丁香酚得率=甲基丁香酚質(zhì)量/華細(xì)辛質(zhì)量×100%

1.2.6 單因素實(shí)驗(yàn)

考察不同料液比(g/mL)、浸泡時(shí)間、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)華細(xì)辛揮發(fā)油中甲基丁香酚得率的影響。按照1.2.2所需方法進(jìn)行后處理和分析獲得得率。

1.2.7 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果對(duì)料液比、浸泡時(shí)間、提取溫度、提取時(shí)間這四個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行篩選，按照每一個(gè)因素對(duì)提取影響的大小順序，，建立正交試驗(yàn)因素水平表。根據(jù)因素水平表由正交設(shè)計(jì)助手Ⅱ軟件建立L9(34)正交試驗(yàn)。按照上述同樣方法后處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 內(nèi)標(biāo)物選擇和方法專屬性實(shí)驗(yàn)

分別對(duì)甲基丁香酚的正辛醇對(duì)照品溶液及1.2.4法提取的樣品溶液進(jìn)行GC分析，所得氣相色譜圖分別如圖1，圖2所示。

由圖1中可知甲基丁香酚的保留時(shí)間為6.611 min，其它組分對(duì)測(cè)定無干擾。

在所選試劑正丁醚、二甲苯、環(huán)己酮、正辛醇中僅正辛醇符合作為內(nèi)標(biāo)物的要求，加入正辛醇的萃取物樣品溶液GC分析氣相色譜圖見圖3。

圖3 細(xì)辛提取樣中加入正辛醇的氣相色譜圖Fig.3 Gas chromatogram of octanol in A.Sieboldii extract

2.1.2 精密度實(shí)驗(yàn)

取8批1.2.4法提取的樣品，每批樣品測(cè)定兩次，測(cè)定結(jié)果如表1所示。表1中，N為批次號(hào)，A1、A2為測(cè)定的甲基丁香酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，A為甲基丁香酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的平均值，R為絕對(duì)極差(=最大值-最小值)為相對(duì)極差(=R/A×100%)。相對(duì)極差平均值=2.52%，根據(jù)相對(duì)極差平均值可推算出測(cè)定相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差:

表1 精確度校核實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of the precision tests

式中，1/d2為由極差估算標(biāo)準(zhǔn)偏差的系數(shù)，對(duì)于成對(duì)試驗(yàn)為0.8865。樣品中甲基丁香酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)在2‰ ～5‰之間，測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.23%，表明儀器精密度良好。

2.1.3 回收率實(shí)驗(yàn)

加標(biāo)前提取樣品中甲基丁香酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.419%，加入一定量的甲基丁香酚的正辛醇標(biāo)準(zhǔn)溶液后，測(cè)得甲基丁香酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.490%，加入標(biāo)準(zhǔn)溶液后的甲基丁香酚質(zhì)量百分?jǐn)?shù)理論值是0.487%，因此，計(jì)算得到甲基丁香酚的回收率為104%，回收率符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 料液比對(duì)甲基丁香酚得率的影響

圖4 料液比(g/mL)對(duì)甲基丁香酚得率的影響Fig.4 Effect of material-liquid ratio on extraction rate of methyl eugenol

圖4為浸泡時(shí)間4 h、提取溫度40℃、提取時(shí)間15 min的條件下，不同料液比對(duì)甲基丁香酚得率的影響。由圖4可知，隨料液比增加，甲基丁香酚得率變大。當(dāng)料液比達(dá)到1∶40時(shí)提取率趨于穩(wěn)定。

超聲振蕩下，提取溶劑量越大，浸潤(rùn)和滲透速度越快，化學(xué)成分溶解速率和擴(kuò)散速度越大，提取率越高，當(dāng)溶劑達(dá)到一定量時(shí)，浸出化學(xué)物質(zhì)趨于飽和?？紤]成本和環(huán)境友好，選擇料液比1∶40進(jìn)行以下單因素實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 浸泡時(shí)間對(duì)甲基丁香酚得率的影響

圖5 浸泡時(shí)間對(duì)甲基丁香酚得率的影響Fig.5 Effect of the immersion time on extraction rate of methyl eugenol

圖5為料液比1∶40、提取溫度40℃、提取時(shí)間15 min的條件下，不同浸泡時(shí)間對(duì)甲基丁香酚得率的影響。由圖5可知，浸泡時(shí)間達(dá)到5 h的時(shí)候，甲基丁香酚提取率達(dá)到最大值，隨后下降。

超聲輔助提取中，提取溶劑滲透到細(xì)胞內(nèi)并將有效化學(xué)成分溶解，由于濃度差關(guān)系，溶解的化學(xué)成分?jǐn)U散到提取溶劑中，但有醇溶性雜質(zhì)、色素等非有效成分同時(shí)溶解并擴(kuò)散出來，與有效成分的擴(kuò)散過程競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致有效成分的擴(kuò)散速率降低，提取率下降。選擇浸泡5 h進(jìn)行以下單因素實(shí)驗(yàn)。

2.2.3 提取溫度對(duì)甲基丁香酚得率的影響

圖6 提取溫度對(duì)甲基丁香酚得率的影響Fig.6 Effect of extraction temperature on extraction rate of methyl eugenol

圖6為料液比1∶40、浸泡時(shí)間5 h、提取時(shí)間15 min的條件下，不同提取溫度對(duì)甲基丁香酚得率的影響。由圖6可知，提取溫度從20℃升高到60℃時(shí)，甲基丁香酚得率升高，60℃ 時(shí)達(dá)到最高，隨后開始下降，70℃后保持穩(wěn)定。

超聲輔助提取過程中，溫度升高導(dǎo)致超聲空化作用產(chǎn)生的沖擊波沖向物料，引起物料內(nèi)部細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化，促使提取溶劑進(jìn)入植物組織細(xì)胞內(nèi)的速度和化學(xué)成分的溶解增大，因此，隨著溫度的升高，甲基丁香酚得率迅速升高。由于植物中的某些化學(xué)成分熱穩(wěn)定性差，隨溫度過高而分解，導(dǎo)致得率下降到一定值后穩(wěn)定。所以選擇60℃進(jìn)行以下單因素實(shí)驗(yàn)。

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)甲基丁香酚得率的影響

圖7 提取時(shí)間對(duì)甲基丁香酚得率的影響Fig.7 Effect of extraction time on extraction rate of methyl eugenol

圖7為料液比1∶40、浸泡時(shí)間5 h、提取溫度60℃的條件下，不同提取時(shí)間對(duì)甲基丁香酚得率的影響。由圖7可知，隨著提取時(shí)間的逐漸增加，甲基丁香酚的得率增大，當(dāng)超聲提取35 min之后，得率變化緩慢并趨于穩(wěn)定。

超聲振蕩下，提取溶劑首先通過細(xì)胞壁進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，然后溶解細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)成分，再擴(kuò)散出細(xì)胞外進(jìn)入提取溶液中，過程復(fù)雜。所以，隨提取時(shí)間增大，進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)的提取溶劑越多，溶解化學(xué)成分的速度越快，擴(kuò)散速度也增大，得率隨之增大。達(dá)到一定提取時(shí)間后，細(xì)胞內(nèi)化學(xué)成分已被充分提取出來，得率不再增加。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，建立正交實(shí)驗(yàn)因素水平表如表2所示。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal test

根據(jù)表2由正交設(shè)計(jì)助手Ⅱ軟件建立L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，通過正交實(shí)驗(yàn)對(duì)超聲輔助提取華細(xì)辛揮發(fā)油中甲基丁香酚的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

從表3中直觀分析可知RA＞RC＞RD＞RB。即四個(gè)因素中料液比對(duì)揮發(fā)油提取率的影響最大，其次是提取溫度和提取時(shí)間，浸泡時(shí)間對(duì)揮發(fā)油提取率的影響最小。

可知UAE法提取華細(xì)辛揮發(fā)油中甲基丁香酚的最佳工藝條件為A3B1C2D3，即料液比1∶40、浸泡時(shí)間3 h、提取溫度60℃、提取時(shí)間40 min。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按上述UAE法提取的最佳工藝條件，重復(fù)提取華細(xì)辛揮發(fā)油中甲基丁香酚3次，甲基丁香酚得率分別為 0.662%、0.657%、0.665%，平均得率為0.661%，絕對(duì)偏差分別為:0.001、-0.004、0.004，相對(duì)偏差分別為:0.151%、-0.605%、0.605%。此條件下的甲基丁香酚得率比正交試驗(yàn)任意組的得率高。

3 結(jié)論

采用超聲輔助提取法提取華細(xì)辛揮發(fā)油中甲基丁香酚并采用內(nèi)標(biāo)法定量分析，分別考察料液比、浸泡時(shí)間、提取溫度、提取時(shí)間等因素對(duì)甲基丁香酚得率的影響，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了甲基丁香酚的超聲提取工藝條件，結(jié)果表明最佳提取條件為:浸泡時(shí)間為3 h，料液比為1∶40，提取溫度為60℃，在此條件下，UAE法提取華細(xì)辛揮發(fā)油中甲基丁香酚需40 min，此條件下平均得率為:0.661%。

表3 甲基丁香酚提取工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal test

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