李 偉，王伯初，楊 憲

重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶 400030

金銀花味甘，性寒。功能清熱解毒、涼血散風(fēng)，主治風(fēng)熱感冒、溫病發(fā)熱等癥［1］。金銀花主要化學(xué)成分有苷類、有機(jī)酸類、揮發(fā)油和黃酮類等［2］。常以綠原酸為主要提取物，近年來，金銀花黃酮類化合物的抗菌作用及其他生物學(xué)活性逐漸引起人們的重視，如唐敏等［3］研究發(fā)現(xiàn)，金銀花黃酮類物質(zhì)具有的抗菌活性優(yōu)于綠原酸。為了更好的對金銀花中黃酮類物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量控制，需要一種優(yōu)秀的前處理方法。中空纖維液相微萃取技術(shù)［4］(hollow fibre-based liquid-phase microextraction，HF-LPME)是一新興的前處理技術(shù)，利用有機(jī)溶劑在中空纖維壁形成液膜，同纖維腔、纖維外溶液形成三相的萃取系統(tǒng)，具有裝置簡單，同時可進(jìn)行純化富集以及便于同液質(zhì)聯(lián)用的優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于環(huán)境科學(xué)、食品檢測等領(lǐng)域［5-7］。本實驗建立了以HF-LPME作為前處理方法，UHPLC-MS作為檢測手段，實現(xiàn)對三種黃酮類成分的檢測。該方法富集倍數(shù)高、靈敏度好、檢測限低。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters Acquity(UPTM)Ultra Performance LC串聯(lián)XE MICROMASS(Waters，USA)超高壓液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀;Quattro Accurel Q 3/2聚丙烯中空纖維 (Membrana，Wuppertal，Germany);800B 型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);78-2型雙向磁力架勢攪拌器(江蘇中大儀器廠);SHZ-M型真空泵(鞏義市英峪儀器廠，中國)。

1.2 材料

金銀花由重慶奇仙中藥材開發(fā)有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)地山東，生產(chǎn)批號110701，購于重慶市西部大藥房。

1.3 試劑

甲醇、甲酸 (Merck公司，色譜純);磷酸、丙酮、乙酸乙酯、正辛醇、三氯甲烷(重慶川東化學(xué)試劑有限公司，分析純);對照品均為中國藥品生物制品檢定所提供;實驗用水為雙蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜、質(zhì)譜條件

色譜條件:色譜柱，Waters BEH C18(50 mm ×2.1 mm，1.7 μm)，流動相，甲醇 (A)和 0.1% 甲酸水溶液 (B)，流速0.2 mL/min;梯度洗脫，即30%A保持3 min，在3 min內(nèi)由30%A線性增加至40%A并保持2 min，隨后在1 min內(nèi)再從40%A線性增至80%A并保持5 min，最后在1 min內(nèi)由80%A線性回落到起始的30%A并保持5 min。進(jìn)樣量4 μL;柱溫30℃。

質(zhì)譜條件:ESI源;源電壓:3.5 kV;錐孔電壓:30 V;正離子檢測，［M+H］+作為定量離子［8］;去溶劑氣和錐孔反吹氣流速分別為700 L/h和50 L/h，氣體為高純N2;碰撞氣流速為0.18 mL/min，維持碰撞池壓力為334 Pa，毛細(xì)管溫度350℃;毛細(xì)管電壓維持在15-50 V。采用全離子掃描方式，掃描范圍m/z 100～1000。

等梯度洗脫流動相體系為甲醇∶水(50∶50);得標(biāo)準(zhǔn)溶液的MS-TIC譜圖(圖1A)和代表樣品譜圖(圖1B)。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取對照品適量，溶于80%甲醇中，制備59.27 μg/mL 蘆丁，65.51 μg/mL 金絲桃苷，82.22 μg/mL槲皮素的對照品儲備液，4℃保存，備用。

圖1 三種黃酮化合物對照品UHPLC-MS總離子流圖(A)和金銀花提取液UHPLC-MS總離子流圖(B)，(1)蘆丁;(2)金絲桃苷;(3)槲皮素Fig.1 UHPLC-MS total ion chromatograms of mixed standard solution(A)and L.japonica sample(B)，(1)rutin，(2)hyperin，(3)quercetin

2.3 供試品溶液制備

精確量取0.1 g粉碎后金銀花樣品，置具塞錐形瓶中，加甲醇100 mL。稱重后，加熱回流1 h，冷卻至室溫。稱重，并用甲醇補(bǔ)足溶液缺失。搖勻后離心，取1.0 mL上清液，氮?dú)獯蹈珊螅芙庥? mL的0.05 mol/L KH2PO4(pH 3.0)溶液，作為供試品溶液。

2.4 HF-LPME工藝參數(shù)的考察

蘆丁、金絲桃苷屬黃酮苷類化合物，槲皮素屬黃酮醇類化合物，選取蘆丁、槲皮素，代表3個黃酮成分，以萃取率(R)和富集倍數(shù)(EF)為指標(biāo)，進(jìn)行工藝參數(shù)的考察。

na:接收相中各黃酮成分的摩爾數(shù);ns:供出相中各黃酮成分的摩爾數(shù);

va接收相的體積;vs供出相的體積;

ca:接收相中各黃酮成分的濃度;cs:供出相中各黃酮成分的濃度;

2.4.1 中空纖維材料的選擇

考察了聚砜和聚丙烯兩種材料，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聚砜材料的中空纖維對有機(jī)膜的粘度不夠，液膜發(fā)生破裂，而聚丙烯中空纖維對于兩種黃酮類化合物的萃取效果均最好，故選用聚丙烯中空纖維作為有機(jī)溶劑的載體。

2.4.2 有機(jī)溶劑的選擇

考察了正丁醇、三氯甲烷和乙酸乙酯三種有機(jī)溶劑，蘆丁、槲皮素的萃取效率同其在UHPLC-MS譜圖中的峰面積正相關(guān)，結(jié)果(如圖2)表明三氯甲烷和乙酸乙酯作為有機(jī)萃取劑對黃酮的萃取效果最好，但考慮到三氯甲烷揮發(fā)性強(qiáng)，故選用乙酸乙酯作為萃取劑，貼纖維壁形成萃取層。

圖2 三種溶劑對兩種黃酮成分的萃取效率Fig.2 The extraction efficiency of three solvents

2.4.3 磁流體加入量的選擇

磁流體粉末加入量過大，會增加體系粘度影響傳質(zhì)的進(jìn)行，但加入量過小，達(dá)不到理想的攪拌效果。以富集倍數(shù)作為指標(biāo)，從圖3可知，加入磁流體份的最佳值為0.25 g。

圖3 納米磁流體加入的量同富集倍數(shù)之間的關(guān)系Fig.3 Effect of magnetic powder on HF-LPME efficiency

2.4.4 萃取時間的選擇

萃取時間越長，萃取效率越高，但同時有機(jī)液膜可能揮發(fā)破損。以富集倍數(shù)為考察指標(biāo)。從圖4可知，在萃取50 min后富集倍數(shù)達(dá)到最大。

圖4 萃取時間與富集倍數(shù)直接的關(guān)系Fig.4 Effect of extraction time on HF-LPME efficiency

2.4.5 環(huán)境pH的考察

給出相和接收相的酸堿度直接影響目標(biāo)物質(zhì)的萃取效率(如圖5、6)，根據(jù)實驗結(jié)果所示，選擇pH 3.0的 KH2PO4作為給出相，pH 8.5 的 NaHCO3溶液作為接收相。

綜上，得到HF-LPME的工藝條件:把中空纖維切為約8 cm的小段，丙酮超聲清洗20 s，重復(fù)3次，晾干。之后浸入乙酸乙酯，超聲10 s，使纖維壁形成有機(jī)層，中空纖維一端接內(nèi)含20 μL NaHCO3緩沖液(pH為8.5，10 mmol/L)的微量進(jìn)樣器。將緩沖液緩緩?fù)迫胫锌绽w維，封閉另一端，固定樣品于交變磁場，攪拌萃取50 min，轉(zhuǎn)速1000 rpm，從進(jìn)樣器中回收接收相，氮?dú)獯蹈桑?0 μL的80%甲醇溶解，取4 μL進(jìn)行UHPLC-MS測定。

2.5 線性關(guān)系、檢測限考察

精密量取對照品儲備液0.01(a)、0.02(b)、0.04(c)、0.08(d)、0.20(e)、0.40(f)、1.00(g)和2.00(h)mL至100 mL容量瓶中，用80%甲醇溶液定容。檢測蘆丁線性關(guān)系采用濃度為c～h的六種稀釋濃度;檢測金絲桃苷采用濃度為b～h七種;檢測槲皮素為a～h八種。分別進(jìn)樣4 μL，以質(zhì)量濃度對峰面積平均值回歸，得回歸方程。

分別取對照品貯備液，用甲醇-0.1%甲酸溶液(30∶70)依次稀釋系列溶液并進(jìn)樣分析，測定峰面積約為噪音3倍(S/N≥3)時的進(jìn)樣質(zhì)量濃度為檢測限 (LOD)。

結(jié)果如表1，發(fā)現(xiàn)在線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)和檢測限良好。

表1 線性關(guān)系、檢測限結(jié)果Table 1 Linear relationship and LOD of rutin，hyperin and quercetin

2.6 精密度試驗

精確取混合對照液，配成 1.00、0.10 和 0.01 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，處理后檢測，各個濃度平行操作5次，日內(nèi)精密度RSD內(nèi)＜5.0%;連續(xù)測定3日得日間精密度RSD間＜6.7%。

2.7 HF-LPME富集倍數(shù)和萃取回收率的計算

取6份供試品，根據(jù)接收相和給出相中三種黃酮物質(zhì)的濃度比，可得富集倍數(shù);據(jù)接收相中三種待測物的摩爾數(shù)和給出相中三種待測物的摩爾數(shù)之比，可以得萃取回收率;計算得出，蘆丁、金絲桃苷和槲皮素的富集倍數(shù)分別為38、42、83倍，萃取回收率分別為 95.34%、95.17%、99.83%，RSD 分別為1.8%、1.3%和 2.2%。

2.8 樣品測定

分別檢測6批供試品，每批平行3份，依上述色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。

表2 金銀花中蘆丁、金絲桃苷和槲皮素的測定結(jié)果(n=3)Table 2 Quantification results of rutin，hyperin and quercetin in L.japonica(n=3)

3 討論

HF-LPME同其他前處理技術(shù)相比，有以下優(yōu)勢:

①成本較低。基本裝置組成是微量進(jìn)樣器(25 μL)、小段多孔中空纖(7～8 cm)、西林瓶(5 mL)和磁力攪拌裝置;②具有優(yōu)秀的富集倍數(shù)，檢測時需要的樣品溶液量很少，在貴重藥質(zhì)量控制中具有很大的優(yōu)勢;同時，運(yùn)用的有機(jī)溶劑較少，僅是纖維掛壁用量，因此相比其他前處理方式，對環(huán)境的影響可忽略;③更適合同色譜技術(shù)聯(lián)用。由于中空纖維孔徑為0.2 μm，在富集的同時又有凈化的作用，供試品從HF-LPME裝置取出后，可直接進(jìn)樣分析;④有多種模式可供選擇，可以同供試品性質(zhì)結(jié)合，達(dá)到最優(yōu)化組合。如按是否攪拌分為動態(tài)、靜態(tài)模式;按溶劑的種類分為兩相、三相模式;⑤不存在交叉污染的問題，因使用的中空纖維較為廉價，一般使用后做丟棄處理，在進(jìn)行連續(xù)處理多個樣品時，不會因為交叉污染而影響痕量分析的結(jié)果。

同文獻(xiàn)［9］相比，可以發(fā)現(xiàn)UHPLC-MS對金銀花樣品進(jìn)行檢測，可有效縮短色譜保留時間(三種黃酮類物質(zhì)的保留時間分別從 10.88、14.68、24.74 min 縮短到 2.5、4.0、10.0 min)，HF-LPME-UHPLCMS可以降低檢測限(從量級μg/mL降低至μg/L)及提高回收率(最低值85.4% 提高至95.3%)。

本研究建立了利用HF-LPME作為UHPLC-MS/MS的前處理技術(shù)，檢測金銀花中的三種黃酮類物質(zhì)的含量，該法具有操作簡便、集純化濃縮為一體的特點(diǎn)，能夠應(yīng)用于金銀花中黃酮類物質(zhì)的檢測。

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2 Lin D(林丹)，Zhao GL(趙國琳)，Liu JJ(劉佳佳).Extraction of active components from flos lonicerae and their bacteriostatic test.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2003，05:436-437.

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