彭 飛，王傳喜，江宏磊，江寧宇，謝 陽(yáng)，陳路劼，江 紅，連云陽(yáng)

福建省微生物研究所，福建省新藥(微生物)篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350007

放線(xiàn)菌是生物活性物質(zhì)的重要來(lái)源，隨著從鏈霉菌(Streptomyces sp.)中發(fā)現(xiàn)新活性物質(zhì)概率的降低，稀有放線(xiàn)菌［1］逐步成為關(guān)注的熱點(diǎn)，如Nocardia、Micromonospora、Microbispora、Saccharothrix、Streptosporangium 等［2，3］。鏈孢囊屬(Streptosporangium)放線(xiàn)菌作為一類(lèi)稀有放線(xiàn)菌，其產(chǎn)生的許多次級(jí)代謝產(chǎn)物因具有抗菌、抗腫瘤等廣泛的生物學(xué)活性而備受關(guān)注，如 platomycins［4］、sibiromycin［5］、sinefungin［6］。

本實(shí)驗(yàn)室從海洋沉積物中分離篩選出一株放線(xiàn)菌FIM09-1157，其發(fā)酵代謝產(chǎn)物具有抑制神經(jīng)氨酸酶活性。本文采用形態(tài)學(xué)描述和16S rDNA序列分析對(duì)該菌株進(jìn)行初步分類(lèi)學(xué)研究，同時(shí)利用各種化學(xué)分離技術(shù)從放線(xiàn)菌FIM 09-1157發(fā)酵液中獲得活性代謝產(chǎn)物T1并進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，研究其體外神經(jīng)氨酸酶抑制活性。

2 材料和方法

2.1 儀器與材料

AV-400核磁共振儀(美國(guó)Bruker公司)，TMS為內(nèi)標(biāo);質(zhì)譜儀(Aligent Quattro Premier Triple Quadrupole mass spectrometer);高效液相色譜儀(SHIMADZU 20A-DAD);Agilent ultimate XB-C18色譜柱(10 × 250 mm，5 μm);Sephadex LH-20(Pharmacia公司);柱色譜硅膠(200～300目)和硅膠H及薄層色譜硅膠GF254(青島海洋化工廠);神經(jīng)氨酸酶抑制劑篩選試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)。

2.2 菌種來(lái)源

FIM09-1157來(lái)自于福建省微生物研究所菌種保藏中心，從臺(tái)灣海峽的海泥樣品中分離得到，其發(fā)酵代謝產(chǎn)物具有神經(jīng)氨酸酶抑制活性。

2.3 菌株FIM 09-1157分類(lèi)學(xué)研究

形態(tài)觀察:菌株FIM09-1157的孢子懸液在高氏-天冬素瓊脂平板上劃線(xiàn)，同時(shí)斜插無(wú)菌蓋玻片，35℃培養(yǎng)，分別于5、10、20天取出蓋玻片，在光學(xué)顯微鏡及電鏡下觀察菌絲及孢子形態(tài)特征。

16S rDNA序列分析:菌株總DNA提取采用劉志恒等人的方法［7］。以總DNA為模板，引物序列如下:27f:5'-agagtttgatcctggctcag-3';1492r:5'-tacggctaccttgttacgactt-3'，Tag酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序采用:94℃預(yù)變性2 min，94℃變性40 s，54℃退火40 s，72℃延伸3 min，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物的測(cè)序由北京泰京生物有限公司完成。測(cè)序結(jié)果在NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)，再通過(guò)軟件Clustalx(version 1.8)對(duì)擴(kuò)增序列和GenBank中近緣典型菌種的序列進(jìn)行比對(duì)，用MEGA4.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2.4 培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)條件

斜面培養(yǎng)基采用含1%NaCl的ISP-3，成熟的培養(yǎng)物從斜面培養(yǎng)基中接入種子培養(yǎng)基:可溶性淀粉15 g;葡萄糖5 g;蛋白胨5 g;酵母粉5 g;K2HPO40.5 g;MgSO4·7H2O 0.5 g;CaCO31 g;NaCl 0.5 g;(NH4)2SO40.5 g;H2O 1000mL;pH7.5;28℃ 220 rpm培養(yǎng)72 h，以8%接種量轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基:可溶性淀粉40 g;葡萄糖5 g;黃豆餅粉20 g;蛋白胨5 g;燕麥 5g;NaCl 0.5 g;MgSO4·7H2O 0.5 g;K2HPO40.5 g;CaCO31 g;H2O 1000 mL;pH7.5;28 ℃ 220 rpm培養(yǎng)120 h。

2.5 分離純化方法

放線(xiàn)菌FIM09-1157發(fā)酵液40 L，4500 rpm離心15 min得上清液。菌絲體用3倍體積的甲醇浸泡2 h，離心后用水稀釋成20%的甲醇浸泡液，上述兩部分合并經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂HP-20吸附，甲醇洗脫，洗脫液減壓濃縮蒸干，加入適量的乙酸乙酯溶解提取3次，合并乙酸乙酯溶液，蒸干得粗品。

粗品用甲醇溶解后硅膠拌樣，上硅膠柱，氯仿-甲醇梯度洗脫，神經(jīng)氨酸酶活性檢測(cè)跟蹤，TLC分析合并相同活性餾份，濃縮后采用Sephadex LH-20凝膠分離，氯仿:甲醇(1∶1)洗脫，活性與TLC跟蹤，活性餾份進(jìn)一步經(jīng)反相C18色譜柱層析(5% ～100%甲醇-水梯度洗脫)和半制備HPLC(ultimate XB-C18，5 μm，10 ×250 mm，甲醇:1‰氨水 =1∶4，238 nm)純化，得到化合物 T1(40mg，tR=25 min)。

2.6 抑制神經(jīng)氨酸酶活性測(cè)試方法

采用96孔熒光酶標(biāo)板測(cè)定，每孔依次加入70 μL神經(jīng)氨酸酶檢測(cè)緩沖液，10 μL神經(jīng)氨酸酶(0.3 U/mL)，5 μL待測(cè)樣品(對(duì)照孔以緩沖液代替)和5 μLMilli-Q水。振動(dòng)混勻1 min，37℃孵育2 min，每孔再加入10 μL神經(jīng)氨酸酶特異性熒光標(biāo)記底物(80 mmol/L)，振動(dòng)混勻1 min，37℃孵育20 min后用M5多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司)測(cè)定熒光強(qiáng)度(F)。激發(fā)波長(zhǎng)為360 nm，檢測(cè)波長(zhǎng)為440 nm。

計(jì)算樣品對(duì)神經(jīng)氨酸酶的抑制率和半數(shù)抑制濃度。公式:抑制率(%)=(F對(duì)照-F樣品)/F對(duì)照×100%。

3 結(jié)果與分析

3.1 菌株FIM09-1157分類(lèi)學(xué)研究

菌株FIM09-1157接種在含1%NaCl的燕麥瓊脂上，28℃培養(yǎng)20 d后，菌落呈圓形，直徑約1～3 cm，邊緣整齊，菌落隆起，表面稍皺折，菌落表面被一層粉紅色粉狀的孢子層覆蓋，基絲的顏色為深粉紅色(Deep Pink)，菌落周?chē)匆?jiàn)可溶性色素產(chǎn)生?；z生長(zhǎng)豐富，分枝較少，無(wú)橫隔，不斷裂，氣絲上有孢囊形成，孢囊圓形，直徑5 ～8 μm(圖1)。

圖1 菌株FIM09-1157掃描電鏡菌絲形態(tài)(ISP9+蜜二糖瓊脂28℃培養(yǎng)30 d)Fig.1 Scanning electron micrograph of strain FIM 09-1157 grown on ISP9+melibiose at 28 °C for 30 days.(Bar，10 μm)

測(cè)得菌株FIM 09-1157的16S rDNA序列1415 bp(Accession number:JQ910638)與 Genebank中基因序列進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌與Streptosporangiumvulgarestrain ATCC 33329同源性最高，達(dá)到99%。采用Neighbor-Jointing法構(gòu)建FIM 09-1157與近緣典型菌株的16S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖2)。菌株FIM 09-1157 與鏈孢囊菌 S.vulgarestrain ATCC 33329、S.purpuratum strain CY-15110 以及 S.yunnanense strain CY-11007處于同一個(gè)分枝。16S rDNA序列分析表明菌株FIM 09-1157屬于鏈孢囊菌(Streptosporangium)，暫定名 為StreptosporangiumFIM 09-1157。

圖2 FIM09-1157與相關(guān)典型菌株的16S rRNA系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree based on the16S rDNA sequences of strain FIM09-1157 and representative species of the genus Streptosporangium(Bootstrap values are shown as percentages at each node)

3.2 化合物T1的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物T1為白色粉末。其甲醇溶液在239 nm和302 nm處有特征UV吸收。ESI-MS:m/z 239［M+H］+，1H-NMR，13C-NMR，1H-1H COSY 以及 HMBC數(shù)據(jù)如表1所示。綜合分析化合物T1紫外、質(zhì)譜及核磁等光譜學(xué)數(shù)據(jù)，結(jié)合文獻(xiàn)［8］，確定化合物T1為硫內(nèi)酯類(lèi)化合物Thiotetromycin?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3。

表1 T1的核磁共振數(shù)據(jù)表Table 1 The NMR spectral data of compound T1

圖3 化合物T1的結(jié)構(gòu)Fig.3 Chemical structure of compound T1

3.3 活性結(jié)果

活性篩選發(fā)現(xiàn)化合物T1體外具有抑制神經(jīng)氨酸酶活性，其半抑制濃度 IC50值為92 μmol/L，而神經(jīng)氨酸酶抑制劑扎那米韋［11］的半抑制濃度IC50值為246.3 μmol/L。當(dāng)濃度達(dá)到210 μmol/L 時(shí)，化合物T1對(duì)神經(jīng)氨酸酶的抑制率達(dá)到96%。

4 討論

已發(fā)現(xiàn)鏈孢囊菌(Streptosporangium sp.)能夠產(chǎn)生許多結(jié)構(gòu)新穎的活性代謝產(chǎn)物，如Spoxazomicins［9］。本文首次從鏈孢囊菌(Streptosporangium sp.)代謝產(chǎn)物中篩選到硫內(nèi)酯類(lèi)抗生素Thiotetromycin，進(jìn)一步說(shuō)明了鏈孢囊菌產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物的多樣性。

抗生素Thiotetromycin［8］是1983年日本科學(xué)家從鏈霉菌(Streptomyces sp.)的發(fā)酵液中分離得到。結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)化合物T1與Thiotetromycin同質(zhì)，與另一個(gè)具有共軛二烯以及5元硫內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物Thiolactomycin［10］結(jié)構(gòu)相似，兩者僅在內(nèi)酯環(huán)側(cè)鏈基團(tuán)上有微小差異(前者為乙基，而后者的側(cè)鏈基團(tuán)是甲基)。本文首次報(bào)道Thiotetromycin具有神經(jīng)氨酸酶抑制活性，其活性強(qiáng)于目前臨床使用的神經(jīng)氨酸酶抑制劑扎那米韋，說(shuō)明此類(lèi)物質(zhì)可能具有潛在的抗病毒活性。本項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)了硫內(nèi)酯類(lèi)化合物新的生物學(xué)活性，為從硫內(nèi)酯類(lèi)化合物中發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎的神經(jīng)氨酸酶抑制劑奠定基礎(chǔ)。

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