馬有智，徐海圣，李雙茂

(1.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058;2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，浙江杭州 310021)

豬支氣管敗血波氏菌 (Bordetella bronchiseptica，Bb)能感染多種哺乳動(dòng)物引起呼吸道隱性感染及急慢性炎癥［1］。Bb可以單獨(dú)或和其他病原菌協(xié)同致病，單獨(dú)感染豬可導(dǎo)致支氣管敗血波氏桿菌病，主要侵害仔豬［2］。Bb和產(chǎn)毒性多殺性巴氏桿菌混合感染則能導(dǎo)致嚴(yán)重的進(jìn)行性萎縮性鼻炎，病豬發(fā)育遲緩，對(duì)飼料利用率降低，仔豬感染甚至出現(xiàn)死亡，給養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。Bb易與支原體、副豬嗜血桿菌、豬流感病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒等感染，引起豬呼吸道綜合征，增加豬群病死率［3］。在所有分離的致病菌中，分離率排在豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌、大腸埃希菌之后列第四［4］，是高熱綜合征細(xì)菌性病原的四大病原之一［5］。我們對(duì)從發(fā)病豬中分離到的細(xì)菌進(jìn)行病原學(xué)研究，以期為預(yù)防和控制該病的流行提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

取發(fā)病豬的肺、肝、脾、心血等組織，劃線接種于5%綿羊鮮血平板，37℃培養(yǎng)24 h，挑取單個(gè)菌落作純培養(yǎng)。用鮮血液平板、BHI培養(yǎng)基的18 h細(xì)菌培養(yǎng)物，分別作革蘭氏染色，觀察其形態(tài)和在固體及液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)特性。用微量生化發(fā)酵管 (購自杭州天和微生物公司)進(jìn)行糖發(fā)酵及其他生化試驗(yàn)，細(xì)菌為18 h培養(yǎng)物。

1.2 PCR鑒定

根據(jù)文獻(xiàn)［6］中的編碼Bb的flagellin的基因序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增后的DNA片段為237 bp。Pl:5’-CCCCGCACATTTCCGAACTTC-3’P2:5’-GGCTCCCAAGAGAGAAAGGCTT-3’，引物由上海生工合成，用ddH2O稀釋為10 μmol·L－1，－20℃保存?zhèn)溆?。?xì)菌DNA提取:用brain heart infusion(BHI)broth 2 mL接種細(xì)菌在37℃下培養(yǎng)20 h，取培養(yǎng)液1 mL 14 000 r·min－1離心30 s，棄上清液。沉淀物中加入滅菌蒸餾水，混勻100℃下煮沸5 min后迅速加入冰塊中，放置5 min，14 000 r·min－1離心2 min，取上清液作為模板DNA使用。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 10 min，94℃ 1 min，55℃1 min，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min。1%瓊脂糖電泳檢測。

1.3 藥物敏感性試驗(yàn)

操作方法及結(jié)果判定參照文獻(xiàn)［7］進(jìn)行。藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.4 小白鼠致病性試驗(yàn)

分離株培養(yǎng)18 h后，傾注法平板計(jì)數(shù)，調(diào)整菌數(shù)約為1億mL－1，分別腹腔注射6只NIH小鼠(小鼠體重15～20 g·只－1，購自浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。小鼠注射劑量為0.2 mL·只－1，觀察發(fā)病和致死情況，連續(xù)觀察6 d，剖檢死亡小鼠，無菌取其心血分離細(xì)菌并鑒定。

1.5 生物被膜 (Biofilm，BF)檢測

體外BF形成于測定方法參照文獻(xiàn)［8］的微孔板法進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)，具體步驟如下:將細(xì)菌過夜培養(yǎng)液與新鮮BHI培養(yǎng)液按1∶3體積混勻后，取200 μL加入到96孔酶標(biāo)板小孔中，37℃濕盒靜置培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，用0.85%的無菌生理鹽水250 μL洗滌2次以去除游離細(xì)菌，干燥后往各孔加入200 μL 0.1%結(jié)晶紫染色液，染色30 min后棄去染色液，0.85%的無菌生理鹽水250 μL洗滌3次，加入33%的乙酸溶液200 μL，待完全溶解后用酶標(biāo)儀測定測其D570值。各試驗(yàn)孔均設(shè)8個(gè)平行孔，以不含菌液的培養(yǎng)液為空白對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

從發(fā)病豬的肺臟實(shí)質(zhì)器官中共分離到4株細(xì)菌，分別命名為Bb5、Bb18、Bb49和Bb51。

2.2 分離菌株的形態(tài)培養(yǎng)特征和理化特性

分離菌株鏡下細(xì)菌分散排列，個(gè)別菌體呈兩極著色，均為革蘭氏陰性小桿菌。在綿羊血平板培養(yǎng)基上分離菌株形成表面光滑，濕潤，邊緣整齊的圓形菌落。4株菌中，Bb5在血平板上呈β溶血，其余3株菌均呈α溶血。在BHI培養(yǎng)基中呈均勻渾濁生長，Bb5菌株在培養(yǎng)液表面能形成明顯的生物被膜 (圖1)。4株細(xì)菌都不分解碳水化合物，觸酶和氧化酶都是陽性。

圖1 分離菌株在BHI培養(yǎng)基中形成的生物被膜

2.3 分離菌株的PCR檢測

結(jié)果 (圖2)顯示，4株分離菌均能擴(kuò)增出預(yù)期大小的237 bp的DNA片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆測序分別與波氏桿菌fla基因 (No.AF232939)序列100%同源性 (序列略)。

圖2 分離菌株的flagellin基因PCR產(chǎn)物

2.4 分離菌株的藥物藥敏性

分離菌對(duì)阿米卡星、卡那霉素、妥布霉素、先鋒必、氧呱嗪青霉素、環(huán)丙沙星、氟派酸、菌必治、氯霉素、慶大霉素等敏感，對(duì)新霉素、紅霉素、壯觀霉素、復(fù)方新諾明、四環(huán)素等不敏感;Bb51對(duì)林可霉素、復(fù)達(dá)欣和氨芐青霉素中度敏感，其他3株菌不敏感 (表1)。

2.5 分離菌株的動(dòng)物致病性

分別接種Bb5、Bb18、Bb49和Bb51細(xì)菌，6只小白鼠中死亡數(shù)分別為5，0，6和1只，對(duì)照組無異常，顯示4株菌對(duì)小白鼠毒力有差異。取死亡鼠心血接種血平板，結(jié)果分離出純的經(jīng)鑒定與接種菌一致的細(xì)菌，證明為豬支氣管敗血波氏桿菌并對(duì)小鼠有一定致病性。

表1 分離菌株對(duì)藥物的敏感性

2.6 分離菌株的生物被膜

4株菌形成生物被膜能力不同，差異分析結(jié)果(圖3)顯示，Bb5，Bb18，Bb49與Bb51之間有極顯著差異。

圖3 分離菌株的生物被膜形成

根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，對(duì)4株分離細(xì)菌從形態(tài)、培養(yǎng)特性、生理生化特征和PCR鑒定等，確定4株分離菌均為支氣管敗血波氏桿菌。在對(duì)該菌培養(yǎng)特性進(jìn)行鑒定過程中，發(fā)現(xiàn)該菌具有較強(qiáng)的變異性，即易于由強(qiáng)毒力的Ⅰ相菌變異為弱毒力的Ⅱ、Ⅲ相菌，表現(xiàn)為初代分離物在血平板上培養(yǎng)可產(chǎn)生綠色色素，在普通瓊脂平板及普通肉湯中生長不產(chǎn)生色素，此特征為強(qiáng)毒力的I相菌的表現(xiàn)。藥

3 小結(jié)和討論

敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，4株菌對(duì)大多數(shù)抗生素的敏感性基本相同，只有Bb51對(duì)林可霉素、復(fù)達(dá)欣和氨芐青霉素中度敏感，而其他3株菌均不敏感。4株菌在液體培養(yǎng)時(shí)，只有Bb5能形成明顯的BF，其他3株菌BF不明顯。BF定量測定顯示，4株菌中，Bb5和Bb18生物被膜形成量最多，而Bb51形成量最少;而動(dòng)物試驗(yàn)顯示 Bb5和 Bb49毒力較強(qiáng)，Bb18和Bb51基本無毒力，說明毒力與BF的形成量沒有明顯的相關(guān)性，這與文獻(xiàn)報(bào)道有一定不同［9］。然而，我們發(fā)現(xiàn)從發(fā)病棘胸蛙分離的嗜水氣單胞菌，其BF與毒力之間具有正相關(guān)性，這可能與細(xì)菌的種類不同有關(guān)。總之，細(xì)菌毒力、BF形成能力與藥物敏感性三方面之間的關(guān)系還需要進(jìn)一步的研究。需要注意的是，體外藥敏試驗(yàn)沒有考慮BF的因素，在動(dòng)物體內(nèi)細(xì)菌以BF的形式黏附于呼吸道黏膜引起耐藥。因此，我們?cè)谂R床對(duì)支氣管敗血波氏桿菌引起的感染治療時(shí)，藥敏試驗(yàn)結(jié)果只能作為參考依據(jù)。

［1］陸承平．獸醫(yī)微生物學(xué)［M］．3版．北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2002:276－277.

［2］斯特勞．豬病學(xué)［M］．8版．北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2000:369－396.

［3］袁翠霞，羅阿東，徐景峨，等．豬萎縮性鼻炎支氣管敗血波氏桿菌PCR檢測方法的建立［J］．中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007(11):896－899.

［4］Zhao Z Q，Wang C，Xue Y，et al．The occurrence of Bordetella bronchiseptica in pigs with clinical respiratory disease［J］．The Veterinary Journal，2011，188:337 －340.

［5］徐引弟，王治方，蔡旭旺，等．河南省規(guī)?；i場高熱綜合征細(xì)菌性病原的分離鑒定［J］．河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010(1):116－118.

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