劉丹丹，楊振龍，吾魯木汗·那孜爾別克

（吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南吉首 416000）

紅斑丹毒絲菌C43065株spaA基因的克隆和表達＊

劉丹丹，楊振龍，吾魯木汗·那孜爾別克

（吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南吉首 416000）

通過PCR從紅斑丹毒絲菌C43065株基因組DNA中擴增出編碼信號肽除外的成熟SpaA蛋白基因spaA，將其克隆到表達載體pET32a的BamHⅠ和HindⅢ位點上，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-spaA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，在IPTG誘導(dǎo)下表達N端帶有Trx標簽的融合蛋白rSpaA，SDS-PAGE檢測表達蛋白.DNA測序結(jié)果表明，spaA基因大小為1794bp，編碼由597個氨基酸殘基組成的成熟SpaA蛋白，SDS-PAGE結(jié)果顯示在大腸桿菌BL21中成功表達了分子量約為86kDa的重組rSpaA，為進一步開展SpaA保護區(qū)域的研究奠定基礎(chǔ).

紅斑丹毒絲菌；spaA基因；克?。辉吮磉_

豬丹毒是一種由豬的血清型1和2紅斑丹毒絲菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）引起的接觸性傳染病，對養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失［1］.目前，預(yù)防豬丹毒的滅活疫苗和弱毒疫苗只能預(yù)防特急性、急性和風(fēng)疹性疾病，而無法預(yù)防本菌引起的慢性疾病，且在疫苗應(yīng)用中仍有疫情再次爆發(fā)，至今世界各地尚未徹底消滅本?。?－3］.因此，研究紅斑丹毒絲菌菌體表面蛋白的免疫功能，為豬丹毒的免疫預(yù)防可提供理論依據(jù).

Kitajima等［4］用血清型2紅斑丹毒絲菌菌體表面蛋白研制疫苗，保護試驗結(jié)果顯示，該蛋白疫苗能保護SPF豬受同源菌株和異源菌株的致死性感染，并推測64～67ku的菌體表面蛋白可能具有保護作用.Makino等［5］用單抗從血清型2紅斑丹毒絲菌基因組文庫中克隆出編碼64ku表面保護性抗原A（surface protective antigen A，SpaA）的基因，用大腸桿菌表達系統(tǒng)分別表達重組rSpaA和缺失C端160個氨基酸殘基的ΔSpaA，并檢測它們對小鼠的保護作用，結(jié)果表明，rSpaA的保護作用與其C端的160個氨基酸序列有關(guān).但Imada等［6］的研究表明，SpaA的保護作用與其N端342個氨基酸序列（SpaA-N）有關(guān).吾魯木汗等［7］用PCR從血清型2紅斑丹毒絲菌基因組中克隆出spaA-N基因序列并進行原核表達，保護試驗結(jié)果顯示，rSpaA-N免疫組小鼠對強毒株C43065攻毒的保護率為100%.

上述研究結(jié)果表明，SpaA是紅斑丹毒絲菌的保護性抗原，但是其C端重復(fù)序列的保護作用尚未清楚.筆者采用PCR從強毒株C43065基因組中克隆出編碼信號肽除外的成熟SpaA的基因，并對spaA基因進行原核表達.

1 材料和方法

1.1 材料

紅斑丹毒絲菌C43065株購自中國獸醫(yī)菌種保藏管理中心；大腸桿菌DH5α和BL21購自大連寶生物工程有限公司；原核表達載體pET32a由本實驗室保存；Ex TaqDNA聚合酶、dNTPs、限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接試劑盒、質(zhì)粒DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、DL2000DNA marker、λ-HindⅢdigest DNAmarker、protein marker均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品；IPTG為Promega公司產(chǎn)品；BHI（Brain Heart Infusion）液體培養(yǎng)基和BHI（Brain Heart Infusion Agar）固體培養(yǎng)基均為Difco公司產(chǎn)品.

1.2 方法

1.2.1 紅斑丹毒絲菌C43065株基因組DNA的提取 BHI固體培養(yǎng)上劃線接種C43065菌株，將單菌落接種于含有質(zhì)量分數(shù)為0.1%Tween-80的BHI（BHI-T）液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)18h，采用CTAB法制備基因組DNA.

1.2.2 spaA基因的PCR擴增和重組表達載體的構(gòu)建 根據(jù)C43065株spaA基因的核苷酸序列（登錄號為：EF688017）設(shè)計引物P1（5′-CGCGGATCCGATTCGACAGATATTTC-3′）和P2（5′-CGCAAGCTTCTATTTTAAACTTCCATC-3′），分別插入BamHⅠ和HindⅢ酶切位點（下劃線部分），引物由大連寶生物工程有限責(zé)任公司合成.PCR反應(yīng)體系為50μL，反應(yīng)條件（溫度／時間）為：94℃／5min；94℃／30s，55℃／1min，72℃／1.8min；35個循環(huán)；最后72℃延伸10min.采用質(zhì)量分數(shù)為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，采用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切PCR產(chǎn)物和載體pET32a并分別進行切膠回收，用DNA連接試劑盒將回收得到的DNA片段和構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-spaA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基篩選陽性克隆，用菌液PCR、BamHⅠ和HindⅢ酶切鑒定重組子，通過DNA測序驗證閱讀框是否正確及有無突變.

1.2.3 重組蛋白rSpaA的表達及檢測 經(jīng)DNA測序證明無誤后，將重組質(zhì)粒pET-spaA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，挑取單菌落接種于5mL的LB培養(yǎng)基（含質(zhì)量濃度為100μg／mL的氨芐青霉素）中，37℃搖床培養(yǎng)6h.分別取0.5mL菌液，接種到2份20mL新鮮的LB培養(yǎng)基（含質(zhì)量濃度為100μg／mL的氨芐青霉素）中，37℃搖床培養(yǎng)，待菌液的OD600值到達0.6時，在其中一份菌液加入IPTG（濃度為0.2mmol／L），30℃繼續(xù)培養(yǎng)4h.取1mL菌液，8000r／min離心2min棄上清收集菌體，菌體用PBS溶液洗滌2次，取50 μL菌液后加等體積2×SDS-PAGE上樣緩沖液100℃煮沸10min.采用4%濃縮膠和12.5%分離膠的SDS-PAGE檢測表達蛋白.為了檢測表達蛋白的表達形式，將誘導(dǎo)后的菌體懸浮于20mL的PBS溶液中，反復(fù)凍融3次后，用超聲波破碎儀破碎菌體（超聲條件：超聲5s間隔6s，共15min），離心收集上清和沉淀，通過SDS-PAGE檢測目的蛋白在大腸桿菌BL21中的表達情況.

2 實驗結(jié)果

2.1 紅斑丹毒絲菌C43065株基因組DNA的制備

采用CTAB法提取C43065株基因組DNA后，用質(zhì)量分數(shù)為0.6%的瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA.結(jié)果顯示C43065株基因組DNA大小約為23kb左右（見圖1），與已報道的紅斑毒絲菌基因組大小一致.

2.2 紅斑丹毒絲菌C43065株spaA基因的PCR擴增

用spaA基因的特異性引物經(jīng)PCR從紅斑丹毒絲菌C43065株基因組DNA中擴增出大小約為1.7kb的片段（見圖2），與預(yù)期值相符.

1 紅斑丹毒絲菌C43065株基因組DNA的瓊脂糖電泳檢測

圖2 紅斑丹毒絲菌C43065株spaA基因的PCR擴增

2.3 重組表達質(zhì)粒pET-spaA的構(gòu)建和鑒定

將上述擴增的PCR產(chǎn)物和pET32a載體分別用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，純化后用DNA連接試劑盒進行連接并構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-spaA.通過PCR檢測在重組質(zhì)粒pET-spaA中的插入DNA片段大小，瓊脂糖電泳檢測結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物大小為1.7kb（見圖3-a），重組質(zhì)粒pET-spaA經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ酶切后獲得1條1.8kb的插入片段（見圖3-b），而DNA測序結(jié)果表明重組質(zhì)粒含有1794bp的插入片段，其編碼信號肽除外的597個氨基酸的成熟SpaA蛋白.

2.4 表達蛋白的SDS-PAGE檢測

SDS-PAGE檢測結(jié)果表明，與對照即空載體pET32a轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21相比，pET-spaA轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21在86ku位置出現(xiàn)表達量較高的蛋白條帶（見圖4泳道3），與預(yù)期的融合蛋白Trx-SpaA分子量相符.表達后的菌體經(jīng)反復(fù)凍融和超聲波破碎后，分別取上清液和沉淀進行SDS-PAGE分析，結(jié)果表明重組rSpaA蛋白以可溶蛋白的形式存在于上清中（見圖4泳道4）.

圖3 重組質(zhì)粒pET-spaA的PCR（a）和酶切（b）鑒定

圖4 重組蛋白rSpaA的表達及其可溶性分析

3 討論

（1）采用PCR從血清型2紅斑丹毒絲菌C43311基因組中克隆編碼SpaA-N的基因片段，用原核表達系統(tǒng)表達rSpaA-N并檢測其保護作用，實驗結(jié)果表明，重組rSpaA-N完全保護小鼠受強毒株C43065的致死性感染［7］.Makino等［8］的研究表明，SpaA的結(jié)構(gòu)及其C端重復(fù)序列和肺炎鏈球菌膽堿結(jié)合蛋白之間有很高的同源性，而SpaA通過其C端重復(fù)序列能夠與枯草芽孢桿菌和肺炎鏈球菌等革蘭氏陽性菌細胞壁的脂磷壁酸（LTA）結(jié)合，提示LTA-SpaA復(fù)合物可能在紅斑丹毒絲菌致病過程中發(fā)揮一定的作用.文獻［7－8］研究結(jié)果可知：SpaA是紅斑丹毒絲菌的主要保護性抗原，可作為豬丹毒亞單位疫苗的候選抗原，但是SpaA蛋白C端重復(fù)序列的保護作用和致病作用尚未清楚.

（2）經(jīng)PCR從紅斑丹毒絲菌C43065基因組中克隆出編碼SpaA蛋白的spaA基因，將其克隆至表達載體pET32a的多克隆位點上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，通過PCR篩選重組菌后提取其質(zhì)粒DNA，DNA測序結(jié)果表明，spaA基因大小為1794bp，編碼597個氨基酸殘基的成熟SpaA蛋白，與已報道的C43065株和C43311株的spaA基因序列完全相同.［9－10］將重組質(zhì)粒pET-spaA導(dǎo)入大腸桿菌BL21感受態(tài)后，通過IPTG誘導(dǎo)表達目的蛋白，SDS-PAGE結(jié)果顯示在重組菌pET-spaA／BL21的超聲波破碎液中觀察到分子量約為86ku的蛋白條帶，與預(yù)期值相符，為進一步開展SpaA蛋白保護區(qū)域及其致病機理的研究奠定基礎(chǔ).

［1］ TAKAHASHI T，F(xiàn)UJISAWA T，TAMURA Y，et al.DNA Relatedness Among Erysipelothrix Rhusiopathiae Strains Representing All Twenty-Three Serovars and Erysipelothrix Tonsillarum［J］.Int.J.Syst.Bacteriol，1992，42（3）：469－473.

［2］ FTHENAKIS G，CHRISTODOULOPOULOS G，LEONTIDES L，et al.Abortion In Ewes Associated with Erysipelothrix Rhusiopathiae［J］.Small Ruminant Research，2006，63（1－2）：183－188.

［3］ EAMENS G，CHIN J，TURNER B，et al.Evaluation of Erysipelothrix Rhusiopathiae Vaccines in Pigs by Intradermal Challenge and Immune Responses［J］.Vet.Microbiol，2006，116（1－3）：138－148.

［4］ KITAJIMA T，OISHI E，AMIMOTO K，et al.Protective Effect of NaOH-Extracted Erysipelothrix Rhusiopathiae Vaccine in Pigs［J］.J.Vet.Med.Sci.，1997，60（1）：9－14.

［5］ MAKINO S，YAMAMOTO K，MURAKAMI S，et al.Properties of Repeat Domain Found in a Novel Protective Antigen，SpaA，of Erysipelothrix Rhusiopathiae［J］.Microb.Pathog，1998，25（2）：101－109.

［6］ IMADA Y，GOJI N，ISHIKAWA H，et al.Truncated Surface Protective Antigen（SpaA）of Erysipelothrix Rhusiopathiae Serotype 1aElicits Protection Against Challenge with Serotypes 1aand 2bin Pigs［J］.Infect Immun.，1999，67（9）：4 376－4 382.

［7］ 吾魯木汗·那孜爾別克，張 磊，何 翠，等.豬丹毒絲菌天然SpaA和重組SpaA-N免疫保護效果的評價［J］.微生物學(xué)報，2010，50（3）：367－372.

［8］ MAKINO SI，YAMAMOTO K，ASAKURA H，et al.Surface Antigen，SpaA，of Erysipelothrix Rhusiopathiae Binds to Gram-Positive Bacterial Cell Surfaces［J］.FEMS Microbiol Lett，2000，186（2）：313－317.

［9］ 吾魯木汗·那孜爾別克，張 磊，何 翠，等.豬丹毒絲菌C43065株表面保護性抗原AN端保護區(qū)在大腸桿菌中的表達［J］.生物技術(shù)通訊，2008，19（4）：548－551.

［10］ 吾魯木汗·那孜爾別克，劉祝祥，李 科，等.豬丹毒絲菌C43311株spaA基因N端免疫保護區(qū)的克隆和表達［J］.微生物學(xué)報，2008，48（2）：207－212.

（責(zé)任編輯 易必武）

Cloning and Expression of spaA Gene of Erysipelothrix Rhusiopathiae C43065

LIU Dan-dan，YANG Zhen-long，NAZIERBIEKE Wulumuhan
（College of Biology and Environmental Sciences，Jishou University，Jishou 416000，China）

The spaA gene encoding mature surface protective antigen A（SpaA）without signal peptide was amplified from genomic DNA of E.rhusiopathiae C43065by PCR，The BamHⅠand HindⅢdigested PCR product was cloned into prokaryotic expression vector pET32ato generate a recombinant plasmid pET-spaA.The recombinant protein rSpaA was expressed in E.coli BL21harboring the recombinant plasmid pET-spaA by IPTG inducing，and the expressed protein was determined by SDS-PAGE.The DNA sequence analysis showed that the spaA gene of C43065strain was 1794bp in length.SDS-PAGE analysis revealed a single protein band with a molecular weight of 86kDa successfully expressed in E.coli BL21.The expressed protein of rSpaA will contribute to further study on protective domain of this protein.

Erysipelothrix rhusiopathiae；spaA gene；cloning；prokaryotic expression

S588.28

A

10.3969／j.issn.1007－2985.2013.05.021

1007－2985（2013）05－0085－04

2013－06－09

國家自然科學(xué)基金資助項目（31072142）

劉丹丹（1987－），女，湖南邵東人，吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院碩士研究生，主要從事微生物生態(tài)學(xué)研究

吾魯木汗·那孜爾別克，吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院教授，博士，從事畜禽傳染病免疫預(yù)防，E-mail：ulum＠jsu.edu.cn.