胡 堯，劉維薇，黃志基

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院檢驗科，上海 200040)

乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)是乙型肝炎診斷及治療評估的重要血清學(xué)標(biāo)志物。在我國的乙型肝炎病毒(HBV)感染人群中，有一部分血清HBsAg呈低水平狀態(tài)存在，用傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測，這部分患者往往會被漏檢。隨著微粒子酶免疫熒光法(micropartical enzyme immunofluorescence assay，MEIA)和電化學(xué)發(fā)光免疫法(electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA)代替 ELISA，HBsAg檢測的敏感性和特異性得到顯著提高，特別是對攜帶弱反應(yīng)性HBsAg人群的檢出率明顯提高。但在檢測敏感性提高的同時，這些弱反應(yīng)性HBsAg檢出存在著假陽性，需要對部分HBsAg弱反應(yīng)性結(jié)果進行確認。為此，我們對采用ECLIA檢測弱反應(yīng)性HBsAg的血清標(biāo)本進行確認，并對確認結(jié)果進行分析和討論。

材料和方法

一、研究對象

2010年6月至2011年2月采用羅氏MODULAR ANALYTICS E-170全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測華山醫(yī)院門診及住院患者HBV血清標(biāo)志物，其中弱反應(yīng)性 HBsAg(1.0 ＜COI＜50.0)100例，男63例，女37例，年齡21～89歲。

二、儀器和試劑

1.儀器 MODULAR ANALYTICS E-170全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，瑞士羅氏公司。

2.試劑 HBV血清標(biāo)志物檢測試劑盒包括HBsAg及其抗體(抗HBs)、HBV e抗原(HBeAg)及其抗體(抗 HBe)、HBV核心抗體(抗 HBc)，HBsAg確認試驗試劑盒以及HBsAg校準品[溯源至世界衛(wèi)生組織(WHO)HBsAg國際標(biāo)準品，亞型adw 2.00/558]，瑞士羅氏公司。室內(nèi)質(zhì)控，Hepatitis and Retrovirus，美國伯樂公司。

三、方法

1.HBV血清標(biāo)志物、定標(biāo)品、室內(nèi)質(zhì)控品的檢測 采用ECLIA，按照羅氏E-170全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀的操作規(guī)程進行，所測結(jié)果均由儀器自動完成。HBsAg＞1.0COI時判為陽性，所有結(jié)果均經(jīng)過復(fù)檢。

2.HBsAg中和確認試驗 操作嚴格按照羅氏E-170儀器的操作規(guī)程進行。所有標(biāo)本均經(jīng)13000×g離心10 min。在標(biāo)本中加入特異性針對HBsAg的人型中和抗體(確認試劑)，如果血清中存在HBsAg，則會被特異性的抗體中和。同時測定同一標(biāo)本加入中和抗體(確認試劑)與未加入中和抗體(對照試劑)的COI值，分別用COI(確認)和COI(對照)表示，計算X=COI(確認)/COI(對照)×100。結(jié)果判斷見表1。

表1 確認試驗判斷標(biāo)準

四、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、100份弱反應(yīng)性HBsAg標(biāo)本的確認試驗

10例陰性結(jié)果和3例不確定標(biāo)本的COI值在1.01 ～1.97 之間，結(jié)果見表2。

二、弱反應(yīng)性HBsAg確認結(jié)果的ROC曲線分析

采用SPSS 11.5軟件對弱反應(yīng)性HBsAg確認試驗結(jié)果進行ROC曲線分析，曲線下面積為0.945±0.0215，當(dāng)ECLIA 檢測HBsAg的 COI值為1.97 時，特異性可達100.0%，敏感性為83.9%。見圖1。

三、不同乙型肝炎血清學(xué)標(biāo)志物模式標(biāo)本低水平HBsAg確認結(jié)果

HBsAg陽性設(shè)定為1，抗HBs陽性設(shè)定為2，HBeAg陽性設(shè)定為3，抗 HBe陽性設(shè)定為4，抗HBc陽性設(shè)定為5，結(jié)果見表3。

表2 100份HBsAg標(biāo)本確認試驗結(jié)果[例(%)]

圖1 弱反應(yīng)性HBsAg確認結(jié)果的ROC曲線

表3 不同乙型肝炎血清學(xué)標(biāo)志物模式標(biāo)本HBsAg確認結(jié)果

討 論

血清HBsAg的弱反應(yīng)性存在可能與HBV感染患者年齡增長，HBV的整合、清除、變異，血清學(xué)轉(zhuǎn)換，出現(xiàn)抗HBs以及含HBV循環(huán)免疫復(fù)合物的形成等有關(guān)，并與來自宿主方面的諸多因素有關(guān)[1-2]。因此準確檢測并報告低水平的HBsAg具有重要的流行病學(xué)和臨床意義[3]。

然而HBsAg檢測結(jié)果呈弱反應(yīng)性可能是假陽性結(jié)果[4]。引起HBsAg假陽性有多種原因，目前認為主要分3類:第1類是由于標(biāo)本分析前和分析中處理不當(dāng)，主要是隨機誤差引起的，如血液標(biāo)本的凝集不完全等所致[5]，可通過同一標(biāo)本復(fù)檢排除。我們收集的100例標(biāo)本，均經(jīng)高速離心復(fù)檢，剔除可能存在的第1類假陽性的標(biāo)本。第2類是同一標(biāo)本復(fù)檢不能排除，必須進行特異抗體中和試驗才能排除，可能存在某些非特異性干擾物質(zhì)[6]。國內(nèi)文獻對 ELISA[7]、MEIA[8-9]等方法檢測低水平HBsAg的確認試驗報道較多，但對ECLIA方法相對報道較少。我們對100例HBsAg檢測結(jié)果COI值在1.00～50.0的血清標(biāo)本進行確認試驗，確認結(jié)果陽性率為87.0%，陰性率為10.0%，還有3例為不確定結(jié)果;10例陰性結(jié)果和3例不確定標(biāo)本的COI值在1.01～1.97之間;而當(dāng)COI值＞1.97時，確認結(jié)果的符合率達到100.0%(79/79)，因此ECLIA對弱反應(yīng)性HBsAg檢測不僅敏感性高，而且具有較高的特異性。ROC曲線分析結(jié)果顯示，當(dāng)ECLIA檢測HBsAg的COI為1.97時，特異性可達100.0%，敏感性為83.9%。我們認為采用ECLIA系統(tǒng)檢測HB-sAg出現(xiàn)弱反應(yīng)性結(jié)果時，當(dāng)COI值＞2.00，基本可以排除假陽性的可能，無需再做確認試驗;而當(dāng)1.00＜COI＜2.00時，建議對這部分被檢者進行復(fù)檢和隨訪，如有可能最好進一步做確認試驗進行確認。由于本研究標(biāo)本數(shù)量有限，尚需大量試驗證實。第3類是中和確認試驗也不能排除，本次研究有3例確認結(jié)果為不確定。究其原因各類文獻都有報道，如HBV疫苗接種后，但此類干擾持續(xù)時間較短[10]。因此，對患者進行短期隨訪，對于HBsAg的確認具有重要價值。

本研究還發(fā)現(xiàn)，弱反應(yīng)性HBsAg標(biāo)本中約有80%的患者處于乙型肝炎“小三陽”狀態(tài)。主要原因是，病程在轉(zhuǎn)換過程中HBsAg含量較低;約有7%的患者存在抗HBs同時陽性，可能存在HBsAg/抗HBs的血清學(xué)轉(zhuǎn)換。乙型肝炎血清標(biāo)志物僅HBsAg陽性4例，經(jīng)確認試驗為陰性，可能存在干擾物質(zhì)。3例不確定的標(biāo)本，HBV血清標(biāo)志物抗HBe、抗HBc呈陽性，需要進一步隨訪。

美國病理學(xué)家協(xié)會(College of American Pathologists，CAP)在其能力驗證(proficiency testing，PT)中要求對弱反應(yīng)性HBsAg結(jié)果進行確認。中和確認試驗對于ECLIA檢測的弱反應(yīng)性HBsAg結(jié)果的確認是一種特異性和敏感性較高的方法。

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