陳莉華，王曉靜，廖 薇，肖 斌，譚林艷，龍進(jìn)國(guó)

(1.吉首大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南吉首 416000;2.吉首大學(xué)植物資源保護(hù)與利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南吉首 416000)

青黛中靛玉紅的提取及其抗氧化活性*

陳莉華1，2，王曉靜1，廖 薇1，肖 斌1，譚林艷1，龍進(jìn)國(guó)1

(1.吉首大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南吉首 416000;2.吉首大學(xué)植物資源保護(hù)與利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南吉首 416000)

利用超聲波輔助乙酸乙酯提取青黛中靛玉紅，考察提取物對(duì)羥基自由基的清除作用及對(duì)油脂氧化的抑制效果，并與檸檬酸和Vc作比較.用乙酸乙酯為提取劑，料液比為1∶10(g/mL)，在40 W超聲功率、13 kHz超聲頻率及250 W加熱功率的條件下超聲50 min，提取率達(dá)到0.12%.提取物對(duì)羥基自由基有一定的清除作用，并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，能增加植物油的抗氧化能力，相同條件下對(duì)油脂的抗氧化效果強(qiáng)于Vc、檸檬酸.

超聲波;乙酸乙酯;青黛;靛玉紅;抗氧化活性

青黛是一種常用傳統(tǒng)中藥，為十字花科菘藍(lán)Isatis indigotica For-tune、蓼科蓼藍(lán)Polygonumtinctorium Ait.、爵床科馬藍(lán)Bap-hicacanthuscusia Bremek.和豆科假藍(lán)靛Indigoferatinctoria L.的葉或莖葉經(jīng)加工制得的干燥粉末或團(tuán)塊，收載于《中國(guó)藥典》2005版一部［1］，具有清熱解毒、涼血消腫、散結(jié)止痛、消斑化瘀之功效，主要用于溫毒發(fā)斑、血熱吐吜、胸痛咳血、口瘡、痄腮、喉痹、小兒驚癇等癥［2］.

青黛的主要活性成分是靛藍(lán)(indigo)與靛玉紅(indirubin)［3］.前人的研究主要集中在青黛中靛玉紅的清熱涼血、抗菌消炎［4-5］、抑制腫瘤細(xì)胞［6-7］等生物活性方面.迄今為止，關(guān)于青黛中靛玉紅抗氧化作用的研究尚未見(jiàn)報(bào)道.筆者利用超聲波輔助乙酸乙酯提取青黛中靛玉紅，研究提取物對(duì)羥基自由基亞的清除作用及對(duì)油脂氧化的抑制作用，以期為青黛的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

儀器:723可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津);KQ250-E型超聲波清洗器(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);K-201B-Ⅱ旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);Gzx-9070MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);電子天平;恒溫槽.

試劑:鹽酸、石油醚、乙酸乙酯、無(wú)水乙醇、95%乙醇、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、過(guò)氧化氫、水楊酸、亞硝酸鈉、檸檬酸、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、三羥基甲基氨基甲烷、鄰苯三酚、氯仿三氯甲烷、冰醋酸、碘化鉀、淀粉等，均為分析純.

材料:植物油(購(gòu)買(mǎi)于吉首市超市)、青黛(購(gòu)于吉首市中草藥店).

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 青黛中靛玉紅的提取及分離 (1)青黛超聲預(yù)處理.準(zhǔn)確稱(chēng)取青黛成藥10.0 g，置于250 mL的燒杯中，取24%鹽酸溶液50 mL，分5次加入并不斷攪拌至沒(méi)有氣泡產(chǎn)生，將燒杯封口，置于80℃的超聲發(fā)生器中超聲50 min后取出燒杯靜置10 min，減壓抽濾，然后用90℃左右熱水50 mL，分5次洗滌濾渣并置于80℃的烘箱中干燥后保存.

(2)石油醚回流脫脂.將上一步得到的干燥的濾渣用10倍量的石油醚于80℃超聲回流50 min，靜置10 min冷卻至室溫，減壓抽濾，用10 mL石油醚分2次洗滌濾渣，于80℃烘箱中干燥后保存.

(3)乙酸乙酯回流提取.將上一步得到的干燥的濾渣用10倍量的乙酸乙酯在80℃超聲回流50 min，靜置10 min，冷卻至室溫，減壓抽濾，取20 mL乙酸乙酯分4次洗滌濾渣，棄去濾渣，濾液保存于一棕色試劑瓶中.

初提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，溫度為75℃，濃縮液置于步驟(3)的棕色試劑瓶中，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)一步減壓濃縮至蒸干，溫度為75℃，蒸干的殘?jiān)尤?5%乙醇50 mL和1%NaOH 100 mL，攪拌均勻，靜置24 h，減壓抽濾，濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收乙醇，溫度為70℃;濾渣于80℃烘箱干燥渣后保存，濾渣即為靛玉紅粉末.

1.2.2 提取物中靛玉紅含量的測(cè)定 以靛玉紅為標(biāo)準(zhǔn)品，用紫外分光光度計(jì)在540 nm處測(cè)定吸光度，繪制靛玉紅濃度-吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線.

將提取得到的靛玉紅粉末置于燒杯中并放在80℃水浴超聲50 min，同時(shí)取20 mL乙酸乙酯分4次加入其中，溶解時(shí)燒杯封口，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)入100 mL的容量瓶中，用乙醇稀釋至刻度定容，搖勻，放置1 0 min，用乙醇為試劑空白，用紫外分光光度計(jì)在540 nm處測(cè)定此溶液的吸光值，由回歸方程計(jì)算靛玉紅含量.

1.2.3 靛玉紅對(duì)羥基自由基的清除 參照Fenton反應(yīng)［8］建立羥基自由基生成模型，在15 mL比色管中依次加入2 mmol/L FeSO4溶液3 mL，2 mmol/L H2O2溶液3 mL，搖勻后，加入6 mmol/L水楊酸溶液3 mL，立即搖勻，于37℃水浴中恒溫15 min后取出，然后分別加入濃度為72.65 mg/L的提取液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mL，最后加入蒸餾水補(bǔ)充體積至15 mL.繼續(xù)在37℃水浴恒溫15 min，在波長(zhǎng)5 10 nm處以空白液為參比測(cè)定其吸光度Ax及本底吸光度Ax0.以蒸餾水代替提取液，按以上方法實(shí)驗(yàn)，在37℃下恒溫15 min后測(cè)其吸光度A0.以同濃度抗壞血酸、檸檬酸做對(duì)比，比較3種物質(zhì)的清除羥基自由基能力.每組測(cè)定重復(fù)3次，按下式據(jù)算羥基自由基的清除率:

其中:A0為空白對(duì)照液吸光值;Ax為待測(cè)樣品液吸光度;Ax0為本底吸光度.

1.2.4 靛玉紅對(duì)油脂氧化的抑制作用 采用國(guó)際上通用的烘箱強(qiáng)化貯存法［9］使之發(fā)生氧化酸敗變質(zhì)，并利用碘量法［10］測(cè)定過(guò)氧化值.

通過(guò)烘箱強(qiáng)化貯存法使油脂發(fā)生氧化，加入靛玉紅考察其對(duì)油脂氧化作用的抑制:稱(chēng)取20 g油脂，加入2 mL純化液，攪拌均勻后，放入烘箱中強(qiáng)化保存，間隔1 h交換在烘箱中的位置并取1 mL待測(cè)樣品，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線方法分別測(cè)定585 nm處的吸光度.然后計(jì)算油脂過(guò)氧化值(POV)及原花青素對(duì)油脂的保護(hù)率η，以抗壞血酸、檸檬酸做對(duì)比，比較3種物質(zhì)的抗氧化能力.

油脂過(guò)氧化值(POV)和保護(hù)率η的計(jì)算公式分別為

其中:W表示油脂質(zhì)量(kg);POV初為未對(duì)油脂進(jìn)行強(qiáng)化氧化時(shí)的過(guò)氧化值，mmol/kg;POV末1為添加靛玉紅的油脂強(qiáng)化氧化后的過(guò)氧化值，mmol/kg;POV末2為未添加靛玉紅的油脂強(qiáng)化氧化后的過(guò)氧化值，mmol/ kg.

2 結(jié)果與討論

2.1 青黛靛玉紅含量測(cè)定及提取率

在實(shí)驗(yàn)確定的最佳條件下青黛中靛玉紅提取率為0.12%.在540 nm處吸光值與靛玉紅的濃度有良好的線性關(guān)系，回歸方程為A=0.012c+0.008 2，R2=0.998 1.亞硝酸鹽測(cè)定的回歸方程A=0.396 9c+0.040 3，R2=0.996 9，亞硝酸鹽在0.0～0.2 mg/L之間有良好的線性關(guān)系.碘量M(μmol)與吸光度A在0.0～0.96 μmol間有良好的線性關(guān)系，回歸方程為M=4.015 3A+0.003 9，R2=0.998 6.

2.2 青黛靛玉紅對(duì)羥基自由基(·OH)的清除

2.2.1 靛玉紅濃度對(duì)羥基自由基(·OH)清除效果的影響 按照實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)一系列不同濃度的靛玉紅提取液、抗壞血酸溶液及檸檬酸溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察各自對(duì)羥基自由基的清除效果，并進(jìn)行比較，結(jié)果如圖1所示.

圖1結(jié)果表明，在濃度2.4～17 mg/L范圍內(nèi)，隨著靛玉紅提取液質(zhì)量濃度的增大，靛玉紅對(duì)羥自由基清除效果逐漸增大，在實(shí)驗(yàn)濃度為1 6.95 mg/L時(shí)，清除率為15.4%，但清除效果不及抗壞血酸、檸檬酸.總體而言，對(duì)羥自由基清除率的排序從大到小為檸檬酸，抗壞血酸，靛玉紅提取液;在濃度2.4～17 mg/L范圍內(nèi)三者清除率均與濃度劑量呈正相關(guān).

2.2.2 溫度對(duì)靛玉紅清除羥基自由基效果的影響 以濃度均為9.68 mg/L的靛玉紅提取物、抗壞血酸及檸檬酸，考察不同溫度對(duì)清除羥基自由基效果的影響，結(jié)果如圖2所示.

圖2結(jié)果表明，同一濃度不同溫度下的清除率有很大的不同.溫度較低時(shí)，對(duì)羥基自由基的清除率較小;隨著溫度升高，對(duì)羥基自由基的清除率逐漸增大，但當(dāng)溫度升高到一定程度后，其清除率有下降的趨勢(shì).在37℃時(shí)抗壞血酸及檸檬酸的對(duì)羥基自由基清除率最大;但靛玉紅提取液在42℃時(shí)對(duì)羥基自由基清除率最大(13.71%).原因可能是靛玉紅的耐高溫性較強(qiáng)，在較高溫度下才發(fā)生自身氧化，因此在較高溫度下仍可以清除羥基自由基.

圖2 溫度對(duì)靛玉紅提取液清除·OH能力的影響

2.3靛玉紅對(duì)油脂的抗氧化性研究

2.3.1 靛玉紅濃度對(duì)油脂的抗氧化性效果的影響 按照實(shí)驗(yàn)方法，40℃條件下，將植物油在烘箱強(qiáng)制保溫一定時(shí)間，對(duì)一系列不同濃度的靛玉紅提取液、抗壞血酸溶液及檸檬酸溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察其對(duì)植物油的保護(hù)效果，結(jié)果如圖3所示.

圖3結(jié)果表明，在濃度2.4～17 mg/L范圍內(nèi)，靛玉紅對(duì)植物油的保護(hù)率較檸檬酸、抗壞血酸的大，其對(duì)油脂的抗氧化作用十分的明顯.隨著靛玉紅質(zhì)量濃度的增大，保護(hù)率逐漸增大，在實(shí)驗(yàn)濃度為1 6.95 mg/L時(shí)，清除率為55.77%，由此可得出靛玉紅對(duì)植物油氧化的抑制效果很好.總體而言，對(duì)植物油氧化的抑制作用排序從大到小為青黛靛玉紅提取液，抗壞血酸，檸檬酸;在濃度2.4～17 mg/L范圍內(nèi)三者對(duì)油脂的保護(hù)率均與濃度劑量呈正相關(guān).

2.3.2溫度對(duì)靛玉紅抗氧化性效果的影響 以濃度均為9.68 mg/L的靛玉紅提取物、抗壞血酸及檸檬酸，考察不同溫度對(duì)植物油的保護(hù)效果，結(jié)果如圖4所示.

圖4結(jié)果表明，同一濃度不同溫度靛玉紅對(duì)植物油的保護(hù)率影響很明顯.同時(shí)表明，溫度較低時(shí)，靛玉紅對(duì)植物油的保護(hù)率較小;隨著溫度升高，靛玉紅對(duì)植物油的保護(hù)率迅速增大，但當(dāng)溫度升高到一定程度后，其保護(hù)率幾乎不變.而對(duì)于抗壞血酸及檸檬酸，在42℃時(shí)均對(duì)植物油保護(hù)率最大;隨后二者有下降的趨勢(shì).原因可能是靛玉紅的耐高溫性較強(qiáng)，在較高溫度下才發(fā)生自身氧化，因此在較高溫度下仍可以保護(hù)植物油.

圖3 濃度對(duì)靛玉紅提取液抑制植物油氧化效果的影響

圖4 溫度對(duì)靛玉紅提取液抗植物油氧化的影響

3 結(jié)語(yǔ)

以乙酸乙酯為提取劑，料液比為1∶10(g/mL)，40 W的超聲功率超聲50 min的條件下，青黛中靛玉紅提取率為0.12%.靛玉紅提取液對(duì)·OH有一定的清除作用，且清除效果與其濃度有劑量效應(yīng)關(guān)系，能很好抑制油脂的氧化作用，在濃度2.4～17 mg/L范圍內(nèi)，它對(duì)植物油的保護(hù)率在15.77%～55.77%，大于Vc及檸檬酸.青黛中的靛玉紅具有良好的抗氧化能力，作為一種新的天然、保健的綠色食品抗氧化劑，具有良好的開(kāi)發(fā)前景.

［1］ 中華人民共和國(guó)國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典［S］.一部.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:138.

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(責(zé)任編輯 易必武)

Extraction of Indirubin from Indigo Naturalis and Its Antioxidant Activity

CHEN Li-hua1，2，WANG Xiao-jing1，LIAO Wei1，XIAO Bin1，TAN Lin-yan1，LONG Jin-guo1
(1.College of Chemistry and Chemical Engineering，Jishou University，Jishou 416000，Hunan China;2.Key Laboratory of Plant Resource Conservation and Utilization，Jishou University，Jishou 416000，Hunan China)

The indirubin was extracted fromnatural indigosby using ultrasonic-assisted ethyl acetate.With the same concentration of ascorbic acid and Vc as the control，the antioxidant activity of indirubin was investigated by testing scavenging effects of·OH and against the peroxidation of oils.The results showed that the extraction ratio of indirubin reached 0.12%under the following conditions:ethyl acetate as extraction agent，1∶10(g/mL)of material-liquid-ratio，40 w ultrasonic power，13 kHz ultrasonic frequency and 250 W heating power within 50 min.Indirubin extract exhibited ability to remove·OHand good inhibitory effect on peroxidation of oils.The antioxidant activity was increased with concentration of indirubin increasing，and the activity was better than those of ascorbic acid and Vc.

ultrasonic;ethyl acetate;indigo naturalis;indirubin;antioxidant activity

R284.1

B

10.3969/j.issn.1007-2985.2013.01.017

1007-2985(2013)01-0072-05

2012-10-31

科技部科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目(10C26214302421;11C26414305373);湘西自治州科技計(jì)劃項(xiàng)目;吉首大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目(2011ZXJJ05)

陳莉華(1961-)，女，湖南吉首人，吉首大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院教授，博士，主要從事納米粒子的生物應(yīng)用研究.