屈長青，張傳開，林 莉，姚星星

1抗衰老中草藥安徽省工程技術(shù)研究中心;2阜陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，阜陽 236041

黑色素廣泛存在于動物、植物和原生動物之中。人體中的黑色素主要聚集在皮膚之中，黑色素異常會導(dǎo)致雀斑、黃褐斑、黑變病和白發(fā)病等相關(guān)疾病。黑色素是在酪氨酸酶的參與下生成的，過程如下:

酪氨酸酶(EC 1.14.18.1)是一種廣泛存在的與黑色素形成密切相關(guān)的含有 Cu2+的金屬酶［1，2］。具有單酚酶和二酚酶的活性。酪氨酸酶的活性與黑色素合成量相關(guān)，控制其活力即可控制黑色素生成量［3］，因此，酪氨酸酶抑制劑如熊果苷和曲酸也被作為具有美白作用的添加劑加入到化妝品中［4］。近年來，含有中藥有效活性成份的化妝品的開發(fā)日益受到國內(nèi)外商家的重視，也深受消費者的青睞，具有很大的市場潛力［5］。

疏毛羅勒(Ocimum basiliam Linn var.ppilosum(wild.)Benth)，一年生草本植物，為唇形科植物，是一種藥食兩用植物，具有營養(yǎng)芳香、調(diào)味、保健等多種功能，可廣泛應(yīng)用于食用、食品工業(yè)、日用化工和醫(yī)藥保健等方面。有報道說，羅勒全草用藥，有驅(qū)風、健胃和發(fā)汗等作用，可治療腸胃病、風濕性關(guān)節(jié)炎等［6］。因羅勒的莖、葉富含芳香油，是重要的調(diào)香原料，所以對其揮發(fā)油的研究較多。如楊洪霞等分析發(fā)現(xiàn)，疏毛羅勒油的主要成分是萜烯及其含氧衍生物［8］。本實驗研究羅勒多糖對酪氨酸酶的作用，在發(fā)掘羅勒最大利用價值的同時，也為試圖找到一種新的美白替代產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

疏毛羅勒(Ocimum basiliam Linn var.ppilosum(wild.)Benth)購于阜陽市農(nóng)貿(mào)市場，為當年4月份采摘，經(jīng)阜陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院董金廷教授鑒定，洗凈晾干。新鮮馬鈴薯。

正丁醇、氯仿、95% 乙醇、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、維生素C(均為分析純);L-酪氨酸購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器

UV-2600A型紫外可見分光光度計;RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;TD25臺式低速自動離心機;AR224CN電子天平;恒溫水浴鍋;Hema冷凍離心機。

2 試驗方法

2.1 酪氨酸酶提取液的制備

參照任紅榮等的方法［5］，稱取去皮切碎馬鈴薯2 g(-20℃冷凍過夜)，按1∶5(m/V)的比例加入磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)10 mL，用力研磨擠壓1 min，立即3000 rpm離心5 min，分離出上清液保存于4℃冰箱，備用。

2.2 羅勒多糖的制備

參照張曉莉等文獻［9］，稱取5 g羅勒，粉碎，加入200 mL雙蒸水，在100℃溫度條件下回流提取2 h。過濾，濾渣繼續(xù)加入150 mL的雙蒸水，繼續(xù)回流提取1 h，合并兩次提取液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至100 mL，放置冷卻，3000 rpm離心5 min，得上清液。然后將得到的上清液與體積比為4∶1的氯仿與正丁醇液混合，除去蛋白。再將去蛋白后的溶液與氯仿充分混合，以除去一些脂溶性的物質(zhì)，最后再將脫脂后的溶液和95%的酒精混合配制成終濃度為80%的酒精多糖溶液，放于4℃冰箱中靜置12 h，3000 rpm離心3 min得深棕色沉降物。用丙酮和無水乙醇分別洗滌沉降物2次，烘干至粉末狀，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 酪氨酸酶抑制率的測定［11，12］

酪氨酸酶活力的測定反應(yīng)總體積為3 mL，具體設(shè)計見表1。

在此體系中，羅勒多糖和維生素C濃度分別為2、3.5、5、6、7、7.5 和 8 g/L。向試管中依次加入PBS緩沖液、不同濃度羅勒多糖和維生素C溶液和酪氨酸酶提取液，于30℃水浴10 min，然后加入底物L-酪氨酸，立即開始計時，測定a、b、c和d管反應(yīng)20 min時475 nm波長下的吸光值。測定時，以雙蒸水為參比溶液。每組設(shè)3個平行。

表1 反應(yīng)物質(zhì)與體積Table 1 Reactive substances and volume

酪氨酸酶的抑制率按如下公式算出:

公式中，ODa、ODb、ODc與 ODd表示各管吸光度。ODa表示不加抑制劑時，酪氨酸酶反應(yīng)體系的吸光度值;ODc表示加了羅勒多糖或維生素C以后，酪氨酸酶反應(yīng)體系的吸光度值;ODb和ODd是沒有添加L-酪氨酸時的吸光度值。根據(jù)實驗得出的數(shù)據(jù)，分別作出羅勒多糖和維生素C對馬鈴薯酪氨酸酶的抑制作用曲線，并依據(jù)濃度-酶抑制率曲線估計半數(shù)抑制濃度(IC50)的近似值。

2.4 數(shù)據(jù)分析

所有的數(shù)據(jù)均用Excel和SPSS11.5軟件處理，各組間數(shù)據(jù)采用最小顯著極差法(LSD法)。

3 試驗結(jié)果

經(jīng)分光光度計檢測不同溶液吸光度，結(jié)果如圖1所示:

圖1 羅勒多糖和維生素C對馬鈴薯酪氨酸酶的抑制作用Fig.1 Inhibition effects of polysaccharide of Ocimum basili am and vitamin C on the activity of potato tyrosinase

從上圖可知，羅勒多糖和維生素C對馬鈴薯酪氨酸酶均有抑制作用;羅勒多糖在較低濃度時，其抑制作用要小于維生素C，濃度為7 g/L時，對酪氨酸酶的抑制作用與維生素C相當，之后，維生素C的抑制作用下降，而羅勒多糖抑制作用繼續(xù)升高，當羅勒多糖濃度為7.5 g/L時抑制率達到82.6%，遠遠高于同濃度的維生素C;當多糖濃度為8 g/L時，抑制作用迅速下降，抑制率為47.8%。根據(jù)濃度-酶抑制率曲線算出羅勒多糖酪氨酸酶的半抑制物濃度IC50約為 4.7 g/L。

4 討論

酪氨酸酶是皮膚黑色素生物合成的關(guān)鍵酶。近年來，隨著化妝品行業(yè)的飛速發(fā)展，酪氨酸酶抑制劑的研究非?；钴S，大量化學(xué)合成的抑制劑及植物來源的天然抑制劑得到開發(fā)應(yīng)用，比如水楊酸類、壬二酸類、果酸、維生素C、曲酸或者由它們合成的衍生物等?！敖M份天然化”及“回歸大自然”的呼聲已成為化妝品工業(yè)的潮流，化妝品的原料天然化倍受重視［13］。

疏毛羅勒，一年生草本，高20～80 cm，其莖、葉富含芳香油，是重要的調(diào)香原料。維生素C是酪氨酸酶的非競爭性抑制劑，能夠很好的抑制酪氨酸酶的活性，已經(jīng)被作為酪氨酸酶的抑制劑添加到化妝品中。本實驗以維生素C為陽性對照，從圖中可以看出羅勒多糖和維生素C對馬鈴薯酪氨酸酶的抑制作用趨勢相似。兩者的濃度在2 g/L到6 g/L的梯度范圍內(nèi)時，抑制曲線均呈現(xiàn)上升趨勢，表明此濃度范圍內(nèi)對酪氨酸酶的抑制率逐漸增強。之后維生素C抑制曲線逐漸下降，表明對馬鈴薯酪氨酸酶的抑制作用降低。而羅勒多糖的則在濃度為7.5 g/L時抑制率達到最高，最大抑制作用可以達到82.6%左右，遠高于維生素C的最高抑制作用。實驗結(jié)果表明，羅勒是一種非常有潛力的酪氨酸酶抑制產(chǎn)品。

本實驗提取的羅勒多糖是粗多糖，其純度需進一步提高，后續(xù)的研究將從優(yōu)化多糖提取工藝和純化方法上入手。在提取工藝上除采用本實驗使用的水提醇沉法外，還可以用酸提取法，堿提取法，超聲波提取法以及超臨界流體萃取等［13］方法。在此基礎(chǔ)上，用超濾法，柱層析法或者色譜法等純化，研究其對酪氨酸酶的抑制作用，為開發(fā)羅勒美白作用提供理論依據(jù)。

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