楊菁菁， 蔣紅云， 張 蘭， 沈斌斌

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，昆蟲生態(tài)研究室，廣州 510642；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，農(nóng)業(yè)部作物有害生物綜合治理綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

生物測(cè)定作為一種手段，廣泛應(yīng)用于新農(nóng)藥的篩選、毒力測(cè)定與藥效試驗(yàn)及抗藥性檢測(cè)等方面。毒力測(cè)定方法包括藥膜法、浸漬法、噴霧法等，這些方法都是利用活體昆蟲進(jìn)行生物測(cè)定，隨著農(nóng)藥創(chuàng)制的發(fā)展，傳統(tǒng)的生物測(cè)定技術(shù)的缺點(diǎn)越來越明顯。特別是在研究天然產(chǎn)物中的殺蟲活性物質(zhì)時(shí)，由于其含量較低，又有協(xié)同、拮抗效應(yīng)，致使工作量加大，成本較高，周期長(zhǎng)，已不能滿足批量新化合物活性篩選的需要，因此，需要一些新的篩選方法來適應(yīng)新農(nóng)藥創(chuàng)制的迅速發(fā)展［1］?；诩?xì)胞水平的試驗(yàn)，以微孔板為試驗(yàn)工具，通過靈敏準(zhǔn)確的檢測(cè)儀器收集數(shù)據(jù)，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，為化合物的大規(guī)模生物活性測(cè)定提供了一種有效的方法［2－3］。

利用離體昆蟲細(xì)胞代替活體進(jìn)行活性測(cè)定是一種直接反映化合物毒性作用的檢測(cè)方法。本試驗(yàn)研究了幾種植物源活性物質(zhì)對(duì)甜菜夜蛾［Spodoptera exigua（Hübner）］IOZCAS－SPEX－Ⅱ和草地貪夜蛾［Spodoptera frugiperda （Smith）］Sf 9細(xì)胞的增殖抑制活性，旨在從細(xì)胞水平上探討幾種植物源活性物質(zhì)的殺蟲活性及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

供試細(xì)胞：甜菜夜蛾中腸脂肪體細(xì)胞IOZCASSPEX－Ⅱ和草地貪夜蛾胚胎細(xì)胞Sf 9，本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)（中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所贈(zèng)送）。IOZCAS－SPEX－Ⅱ細(xì)胞培養(yǎng)于 Hink’s TNM （Sigma，USA），Sf 9細(xì)胞培養(yǎng)于Sf－900TMII SFM （Invitrogen，USA）。培養(yǎng)基添加10% 胎牛血清（Invitrogen，USA），100U青霉素和100U鏈霉素。培養(yǎng)條件為（26±1）℃，RH70%～80%，每4～6d傳代一次。

供試藥劑、試劑及儀器：喜樹堿（camptothecin）（99.17%）和羥基喜樹堿 （hydroxycamptothecin）（99.44%）購買于四川南部縣誠(chéng)信科技有限公司；魚藤酮 （rotenone）（95%）和 印 楝 素 （azadirachtin）（95%）購于美國(guó)Sigma公司；烏頭堿（aconitine）、次烏頭堿（hypaconitine）、偽石榴皮堿（pseudopelletierine）、馬錢子堿（strychnine）和吳茱萸堿（evodiamine）為購于中國(guó)藥品生物制品檢定所的標(biāo)準(zhǔn)品；DMSO（英國(guó)Invitrogen公司；99.9%）、CellTiter 96?AQueous One Solution細(xì)胞增殖試劑盒購于美國(guó)Promega公司；HPS－160培養(yǎng)箱購于哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；TECAN infinite M200 pro酶標(biāo)儀購于瑞典Tecan公司。

1.2 方法

1.2.1 植物源活性物質(zhì)溶液配制

喜樹堿、羥基喜樹堿、烏頭堿和馬錢子堿分別溶于DMSO中配制1.0×104μmol／L，放在4℃冰箱保存；次烏頭堿溶于DMSO中配制6.65×104μmol／L；吳茱萸堿溶于 DMSO 中配制5.6×104μmol／L；偽石榴皮堿溶于DMSO中配制1.142×105μmol／L，放在4℃冰箱保存，使用液用DMSO稀釋至所需濃度。

1.2.2 植物源活性物質(zhì)對(duì)昆蟲細(xì)胞增殖的抑制作用

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的IOZCAS－SPEX－Ⅱ 和Sf 9細(xì)胞，調(diào)整培養(yǎng)細(xì)胞濃度為105個(gè)／mL。根據(jù)CellTiter 96?AQueous One Solution試劑盒說明書，以每孔80μL接種96孔板，12h后，分別加入喜樹堿、羥基喜樹堿、烏頭堿、次烏頭堿、馬錢子堿、吳茱萸堿、魚藤酮和印楝素使其終濃度為1.0×10－3、1.0×10－2、1.0×10－1、1.0×100、1.0×101、1.0×102μmol／L，對(duì)照組加入 DMSO（1μL），每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行孔。培養(yǎng)2、6、12、24、48、72h后，分別加入CellTiter 96?AQueous One試劑10μL，繼續(xù)培養(yǎng)2h后，用酶標(biāo)儀在490nm處測(cè)定吸光度，按下面公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率：

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 幾種植物源活性物質(zhì)對(duì)Sf 9細(xì)胞增殖的抑制活性

如圖1所示，喜樹堿、羥基喜樹堿和魚藤酮對(duì)Sf 9細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制性明顯高于其他植物源活性物質(zhì)。在同一時(shí)間內(nèi)，喜樹堿、羥基喜樹堿和魚藤酮隨著濃度的升高，對(duì)Sf 9細(xì)胞生長(zhǎng)抑制性逐漸升高，說明喜樹堿、羥基喜樹堿和魚藤酮對(duì)細(xì)胞毒性有明顯的劑量效應(yīng)。在同一濃度時(shí)，喜樹堿、羥基喜樹堿和魚藤酮對(duì)Sf 9的抑制活性隨著時(shí)間的改變也發(fā)生了變化，表明這3種植物源活性物質(zhì)對(duì)Sf 9細(xì)胞的增殖抑制作用具有時(shí)間依賴性。而烏頭堿、次烏頭堿、偽石榴皮堿、馬錢子堿、印楝素及吳茱萸堿在同一時(shí)間內(nèi)，隨著濃度的升高，對(duì)Sf 9細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率總體上沒有明顯差異，但是這幾種植物活性物質(zhì)其對(duì)細(xì)胞均有一定的毒性。

2.2 幾種植物源農(nóng)藥對(duì)IOZCAS－SPEX－Ⅱ細(xì)胞的增殖抑制活性

從圖2可以看出：喜樹堿、羥基喜樹堿和魚藤酮在同一時(shí)間內(nèi)，隨著濃度的降低，對(duì)甜菜夜蛾IOZCAS－Spex－Ⅱ細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率逐漸降低，細(xì)胞的生長(zhǎng)存活率升高；同時(shí)，在同一濃度，隨著時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，喜樹堿、羥基喜樹堿和魚藤酮12h與其他時(shí)間有著顯著性差異，說明喜樹堿、羥基喜樹堿和魚藤酮在12h中對(duì)細(xì)胞的抑制性達(dá)到了頂峰。喜樹堿、羥基喜樹堿和魚藤酮對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制性明顯高于其他植物活性物質(zhì)，這說明喜樹堿、羥基喜樹堿和魚藤酮對(duì)細(xì)胞的毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他幾種活性物質(zhì)。而烏頭堿、次烏頭堿、偽石榴皮堿、印楝素、馬錢子堿和吳茱萸堿在同一時(shí)間隨著濃度的降低，甜菜夜蛾SPEX－Ⅱ細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率沒有明顯的變化；同時(shí)，在同一濃度中，隨著時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，在12h中與其他時(shí)間存在著顯著差異，這也說明其活性物質(zhì)本身對(duì)細(xì)胞液有一定的毒性，從而產(chǎn)生抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的效果。

圖1 不同植物活性物質(zhì)在不同時(shí)間不同濃度對(duì)Sf 9細(xì)胞增殖的抑制作用Fig.1 Propagation inhibition of Sf 9cells by several plant－derived compounds on time and dosage scales

圖2 植物活性物質(zhì)對(duì)IOZCAS－SPEX－Ⅱ細(xì)胞增殖的抑制率Fig.2 Propagation inhibition of IOZCAS－SPEX－Ⅱ cells by several plant－derived compounds on time and dosage scales

3 討論

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞工程已經(jīng)越來越受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視?；诩?xì)胞水平的篩選具有靶標(biāo)均質(zhì)性好，試驗(yàn)條件容易控制等優(yōu)點(diǎn)，利用24孔板、96孔板，使得待測(cè)化合物變得越來越微量化，篩選成本更低，篩選量更大，這對(duì)篩選化合物庫中的活性物質(zhì)具有重要的意義。Stipanovic等［4］測(cè)定了棉酚系列天然產(chǎn)物對(duì)煙芽夜蛾［Heliothis virescens（Fabricius）］細(xì)胞系的毒力，試驗(yàn)結(jié)果與活體毒力測(cè)定和田間小區(qū)試驗(yàn)有良好的相關(guān)性。張志祥等［5］利用MTT法對(duì)19種茼蒿素類似物進(jìn)行了離體細(xì)胞篩選，取得了良好的試驗(yàn)結(jié)果。

本試驗(yàn)采用在不同時(shí)間不同濃度下，測(cè)定不同植物源活性物質(zhì)對(duì)甜菜夜蛾IOZCAS－SPEX－Ⅱ和草地貪夜蛾Sf 9細(xì)胞的增殖抑制性。在本試驗(yàn)體系（100μL）中，DMSO使用劑量均為1μL，在測(cè)定的時(shí)間范圍內(nèi)（2、6、12、24、48、72h），該劑量下 DMSO對(duì)兩種昆蟲細(xì)胞的增殖抑制率范圍均為3%～5%。結(jié)果表明，喜樹堿、羥基喜樹堿和魚藤酮對(duì)昆蟲細(xì)胞的增殖具有良好的抑制作用，并且具有時(shí)間和劑量效應(yīng)。烏頭堿、次烏頭堿、偽石榴皮堿、印楝素、馬錢子堿和吳茱萸堿對(duì)IOZCAS－SPEX－Ⅱ和草地貪夜蛾Sf 9細(xì)胞也具有一定的毒性，但是不具有明顯的劑量效應(yīng)。如烏頭堿、次烏頭堿、偽石榴皮堿、馬錢子堿和吳茱萸堿對(duì)Sf 9細(xì)胞毒性結(jié)果出現(xiàn)隨著劑量升高抑制效果下降，一定程度的波動(dòng)現(xiàn)象，但不具有顯著的劑量關(guān)系，這可能與試驗(yàn)存在一定的誤差，設(shè)置濃度極差較大，植物源活性物質(zhì)具有不同的作用機(jī)制有關(guān)。昆蟲細(xì)胞離體篩選的主要是呼吸抑制劑、核酸與蛋白質(zhì)合成抑制劑等，而對(duì)于其他作用方式的化合物，則很難直接利用離體細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定。如有神經(jīng)毒性的化合物，由于細(xì)胞中沒有神經(jīng)突觸，化合物在細(xì)胞體系中因找不到相應(yīng)的靶點(diǎn)而毒力相對(duì)較低，甚至表現(xiàn)為無毒，有時(shí)可能會(huì)漏篩一些具有高活性的化合物［6－7］。因此，基于離體細(xì)胞的生物測(cè)定，可以作為活體篩選的補(bǔ)充手段，同時(shí)也可作為一種藥物作用機(jī)理研究的有效工具。

［1］ 周青春，萬樹青，劉釗杰.利用MTT法測(cè)定殺蟲劑對(duì)細(xì)胞的毒力［J］.植物保護(hù)學(xué)報(bào)，1996，23（4）：343－348.

［2］ 邱立紅，張文吉，王成菊，等.高通量篩選在新農(nóng)藥創(chuàng)制研究中的應(yīng)用［J］.農(nóng)藥科學(xué)與管理，2002，23（5）：20－25.

［3］ Jensen N A，Gerth K，Grotjohann T，et al.Establishment of a high content assay for the identification and characterization of bioactivities in crude bacterial extracts that interfere with eukaryotic cell cycle［J］.Journal of Biotechnology，2009，140（1－2）：124－134.

［4］ Stipanovic R D，Elissalde M H，Altman D W，et al.Cell culture bioassay to evaluate allelochemical toxicity to Heliothis virescens （Lepidoptera：Noctuidae）［J］.Journal of Economic Entomology，1990，83（3）：737－741.

［5］ 張志祥，徐漢虹，程?hào)|美，等.利用MTT法以茼蒿素類似物對(duì)昆蟲細(xì)胞毒力篩選及測(cè)定［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，21（3）：29－32.

［6］ 徐紅星，俞曉平，陳建明，等.殺蟲劑離體細(xì)胞生物測(cè)定研究［C］∥楊懷文.第三屆全國(guó)綠色環(huán)保農(nóng)藥新技術(shù)、新產(chǎn)品交流會(huì)暨第二屆全國(guó)生物農(nóng)藥研討會(huì)論文集.北京：中國(guó)學(xué)術(shù)期刊電子雜志社，2004：227－230.

［7］ 鄭丙蓮，楊紅，洪華珠，等.八種昆蟲離體細(xì)胞系對(duì)滅多威農(nóng)藥的敏感性研究［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2000（5）：30－36.