劉建拓， 張麗紅， 王國秀

（華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遺傳調(diào)控與整合生物學(xué)湖北省重點實驗室，武漢 430079）

染色體數(shù)目、形態(tài)、大小等特征具有種的特異性，即每種生物都具備自己特有的核型（karyotype）［1］。核型分析（karyotype analysis）是對整套生物染色體的形態(tài)特征進(jìn)行綜合分析，是生物分類的重要依據(jù)［2］，對生物的遺傳變異、發(fā)育機制以及物種的起源進(jìn)化等研究有著重要理論價值［3］。同時，染色體中的性染色體與性別決定有關(guān)［4］，因此核型分析對確定不同的性別決定機制也具有重要意義。

中華 卵 索 線 蟲 （Ovomermis sinensis Chen et al.）是一種昆蟲病原索科線蟲，其寄生前期幼蟲能主動侵染斜紋夜蛾［Prodenia litura（Fabricius）］、黏蟲［Mythimna separata （Walker）］、棉鈴蟲［Helicoverpa armigera （Hübner）］等鱗翅目幼蟲，寄生率即等于害蟲死亡率，具有很大的生物防治潛力和潛在應(yīng)用價值［5］。為充分利用這一寶貴資源，研究人員試圖通過體外培養(yǎng)來解決其大量繁殖問題，但由于培養(yǎng)過程中性別沒分化，生殖腺不發(fā)育、未能獲得成功［6］。因此，中華卵索線蟲性別決定機制成為目前研究的重點。已有的生物學(xué)研究結(jié)果表明，中華卵索線蟲性別分化是由線蟲的感染強度及其宿主體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的豐度所決定。感染強度越大，每條線蟲吸收的營養(yǎng)越少，越有可能發(fā)育為雄蟲，反之，則為雌蟲［7］。這種特殊的營養(yǎng)決定性別分化機制，在動物界極其少見［8］。目前，本課題組從線蟲生理生化及分子生物學(xué)水平對該機制進(jìn)行了初步研究，取得了階段性成果［9－11］，并對中華卵索線蟲營養(yǎng)決定性別分化的分子機理有了一定的認(rèn)識。但迄今，尚未有人從細(xì)胞水平研究這一特殊性別決定機制。為此，本試驗從染色體組學(xué)方面，對中華卵索線蟲染色體數(shù)目及核型進(jìn)行了研究，探究性染色體的有無，旨在進(jìn)一步了解中華卵索線蟲的性別決定機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

中華卵索線蟲：2001年河南上蔡縣麥田采得，本實驗室通過宿主棉鈴蟲在（28±1）℃恒溫培養(yǎng)箱傳代培養(yǎng)，挑取活力良好的雌、雄成蟲為試驗材料。

棉鈴蟲（宿主）：購于中國科學(xué)院病毒所（武漢），（28±1）℃恒溫培養(yǎng)箱飼養(yǎng)。

1.2 試劑

（1）線蟲生理鹽水：0.70%NaCl溶液。2.8g NaCl溶于ddH2O（雙蒸水）至400mL，4℃冰箱保存。

（2）秋水仙素溶液：秋水仙素由Sigma公司提供。以0.7%生理鹽水配制成濃度為0.4mg／mL溶液，置于棕色瓶中，高壓滅菌，4℃冰箱保存。

（3）低滲溶液：0.075mol／L KCl溶液。0.28g KCl溶解于ddH2O至50mL，室溫保存。

（4）分散液：V（冰乙酸）∶V（50%乳酸）＝3∶1。先用ddH2O和乳酸按體積比配制成50%乳酸溶液，之后按比例加入冰乙酸，配制成分散液，室溫保存。

（5）固定液、磷酸緩沖液、Giemsa染色液配制：方法見鄭喜邦等［12］。

A.1／15mol／L 磷 酸 鹽 緩 沖 液 （PBS，pH＝6.8）：無水 Na2HPO49.465g，KH2PO49.047g，分別配成1000mL溶液，然后取 KH2PO4溶液510mL和Na2HPO4溶液490mL，混合即可，也可按比例配制PBS溶液。

B.Giemsa原液：Giemsa粉由Sigma公司分裝。Giemsa粉0.5g，甘油33mL，將少量甘油先與Giemsa粉混合后，用研缽進(jìn)行研磨，直至顆粒消失為止，然后再將剩余甘油全部倒入，56℃水浴鍋中保溫2h，最后加入33mL的甲醇，保存于棕色瓶內(nèi)，置于陰暗處，待用拿出。

C.0.91%的Giemsa應(yīng)用液：按Giemsa原液和磷酸鹽緩沖液（PBS，pH＝6.8）1∶10比例配制染液，置于陰暗處。

1.3 試驗方法

（1）秋水仙素處理：挑取活力好的中華卵索線蟲雌、雄成蟲，置于濃度為0.4mg／mL秋水仙素溶液處理2h。

（2）生殖腺的提?。簩⒕€蟲置于潔凈玻片上，在蟲體前1／3處截斷，用刀背將生殖腺擠壓出來，解剖鏡下用昆蟲針仔細(xì)挑出生殖腺。

（3）低滲處理：將生殖腺迅速置于裝有0.075mol／L KCl溶液的1.5mL EP管中，低滲處理1h（28℃）。

（4）固定：1.34×104r／min離心3min，棄上清，用新配制的卡諾氏固定液［V（無水甲醇）∶V（冰乙酸）＝3∶1］，固定20min，1.34×104r／min離心2min，重復(fù)3次，每次固定加入新配制固定液。

（5）分散與終固定：用昆蟲針挑出生殖腺，置于預(yù)冷無菌的玻片上，迅速滴入少量分散液［V（冰乙酸）∶V（50%乳酸）＝3∶1］，使細(xì)胞分散開來，然后再加上述固定液固定。

（6）染色制片：加一滴 0.91%Giemsa染液（pH＝6.8，磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋配制），室溫下染色20min，流水沖洗，自然干燥。

（7）觀察拍照分析：顯微鏡下觀察、拍照，選取染色體分散良好的中期分裂相進(jìn)行染色體統(tǒng)計分析，計算染色體的相對長度及臂比值，參照Levan標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行染色體分類，即臂比值為1.0～1.7、1.7～3.0、3.0～7.0及7.0～∞分別代表中著絲粒染色體、亞中著絲粒染色體、亞端著絲粒染色體以及端著絲粒染色體。

2 試驗結(jié)果

中華卵索線蟲單倍體數(shù)目為6（圖1），二倍體數(shù)目為12（圖2），染色體相對長度最長為9.25，最短為5.71，臂比值介于1.18與2.10之間，其核型公式為2n＝2x＝3sm＋3m，其中1、3、4號為亞中著絲粒染色體，2、5、6號為中著絲粒染色體（表1），其核型模式圖如圖3。試驗結(jié)果證實雌、雄中華卵索線蟲染色體數(shù)目一致，未發(fā)現(xiàn)異形性染色體與隨體。

圖1 中華卵索線蟲單倍染色體（10×100）Fig.1 The haploid chromosomes of O.sinensis（10×100）

圖2 中華卵索線蟲中期分裂相與核型圖（10×100）Fig.2 The metaphase chromosomes and karyogram of O.sinensis（10×100）

表1 中華卵索線蟲染色體相對長度及臂比值Table 1 Relative length and arm ratio of O.sinensis chromosomes

圖3 中華卵索線蟲核型模式圖Fig.3 The idiogram of O.sinensis karyotype

3 討論

3.1 染色體制備方法探討

核型分析最關(guān)鍵的是試驗材料，一般線蟲的核型分析是取材成蟲精巢和卵巢。但由于中華卵索線蟲的精巢或卵巢很難分離，所以本試驗以整條活力好的線蟲為試驗材料。本試驗進(jìn)行了以下優(yōu)化：（1）由于中華卵索線蟲體內(nèi)充滿滋養(yǎng)體（脂肪粒），顯微鏡下無法看清其內(nèi)部結(jié)構(gòu)，使解剖提取其生殖腺的難度加大，也易導(dǎo)致精巢和卵巢丟失或活力下降。因此，本試驗采用先用秋水仙素處理整條線蟲，然后解剖并提取生殖腺；（2）處理過程中，秋水仙素濃度與處理時間同樣會影響到染色體制備。由于中華卵索線蟲體壁很厚，低濃度（0.02mg／mL）秋水仙素溶液很難滲透到蟲體內(nèi)發(fā)揮作用，所以必須提高秋水仙素濃度，經(jīng)試驗反復(fù)摸索，當(dāng)濃度為0.4mg／mL，處理時間2h時，其效果達(dá)到最好。

3.2 核型分析與性別決定機制

國內(nèi)關(guān)于昆蟲病原索科線蟲的研究，主要停留在形態(tài)分類、資源調(diào)查、生物學(xué)特性等［13］。近年開始涉及分子生化方面研究，但有關(guān)此類線蟲細(xì)胞遺傳學(xué)方面的研究，還從未有報道。中華卵索線蟲的核型分析，從細(xì)胞遺傳學(xué)角度為其營養(yǎng)決定性別分化機制提供了重要科學(xué)依據(jù)。

線蟲性別決定機制是復(fù)雜多樣的，但總體上主要分為兩類：基因決定型（genotypic sex determination，GSD）和環(huán)境決定型（environmental sex determination，ESD）。研究表明，昆蟲病原索科線蟲性別是由營養(yǎng)環(huán)境決定的［14］，這種機制在動物界極其特殊。為深入了解這一機制，本試驗對中華卵索線蟲的染色體進(jìn)行了研究，探究其有無性染色體。結(jié)果表明，中華卵索線蟲二倍體染色體數(shù)目為12，且雌、雄蟲染色體數(shù)目一致，這首先排除了XX／XO性別決定類型；通過對其核型分析發(fā)現(xiàn)，配對染色體之間形態(tài)特征差異不顯著，未發(fā)現(xiàn)異形性染色體（見圖2），不存在典型的XX／XY性別決定類型。以上結(jié)果表明，中華卵索線蟲性別決定應(yīng)該為環(huán)境決定型，這也與前人的研究結(jié)果相一致［14］。盡管如此，染色體形態(tài)學(xué)結(jié)果也不能完全排除中華卵索線蟲存在性染色體的可能，由于物種進(jìn)化比較低級，性染色體分化程度低，雖然性染色體有一定的分化，但在形態(tài)上分辨不出來，這種情況在魚類就有發(fā)現(xiàn)，有研究表明，大部分魚類核型無異形性染色體，但通過進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)一些魚類存在性染色體，如通過C－帶技術(shù)，科學(xué)家證明了美洲齒鯉（Poecilia sphenops）和Pseudatocindus tetensis的性別決定類型分別為ZZ／ZW 和 XX／XY［4］。

綜上所述，本試驗首次從細(xì)胞水平對中華卵索線蟲染色體進(jìn)行了形態(tài)學(xué)研究，對其染色體數(shù)目、類型進(jìn)行了分析，未發(fā)現(xiàn)異形性染色體，這一結(jié)果從細(xì)胞的角度佐證了該線蟲環(huán)境決定性別分化機制。

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