郭立新， 譚 毅， 劉永豐， 鄧叢良， 段維軍， 許鄒亮

（1.北侖出入境檢驗(yàn)檢疫局，寧波 315800；2.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局，北京 101312；3.寧波出入境檢驗(yàn)檢疫局，寧波 315012；4.北京藍(lán)譜生物科技有限公司，北京 100086）

南芥菜花葉病毒（Arabis mosaic virus，ArMV）是豇豆花葉病毒科（Comoviridae）線蟲(chóng)傳多面體病毒屬（Nepovirus）成員。其寄主范圍廣泛，可侵染174屬215種植物，引起最常見(jiàn)癥狀是葉片斑駁和脫落、植株矮化、嚴(yán)重畸形、耳突［1］。ArMV主要經(jīng)汁液摩擦和介體線蟲(chóng)傳播，傳播介體主要為異尾劍線蟲(chóng)（Xiphinema diversicaudatum），ArMV 也可通過(guò)種子、鱗球莖、塊莖和苗木等無(wú)性繁殖材料遠(yuǎn)距離傳播［1－2］。該病毒主要分布在荷蘭、比利時(shí)等歐洲國(guó)家和美國(guó)、加拿大、澳大利亞、新西蘭、南非、日本，我國(guó)尚未有報(bào)道［1，3］。

目前，ArMV的檢測(cè)主要采用生物學(xué)［4］、電子顯微鏡［4］、血清學(xué)［1，5－6］、RT－PCR［1－2，5－6］、實(shí)時(shí)熒光 RTPCR方法［1，7］，而未見(jiàn)有環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop－mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)檢測(cè)的報(bào)道。LAMP技術(shù)是Notomi等［8］2000年首先提出來(lái)的一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)依賴于能夠識(shí)別靶序列上6個(gè)特異區(qū)域的引物和一個(gè)具有鏈置換特性的 DNA 聚合酶（Bst DNA polymerase），在等溫條件下高效擴(kuò)增靶基因，靈敏度和特異性高［8］。該方 法 已 應(yīng) 用 于 病 毒［9－12］、類 病 毒［13］、細(xì) 菌［14］、真菌［15］及轉(zhuǎn)基因［16］的檢測(cè)。本研究根據(jù)南芥菜花葉病毒外殼蛋白基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，成功建立了ArMV的RT－LAMP檢測(cè)體系，用于ArMV的快速檢測(cè)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源

1份南芥菜花葉病毒陽(yáng)性質(zhì)控物，購(gòu)自美國(guó)Agdia公司，簡(jiǎn)寫(xiě)為Ar－A；另1份南芥菜花葉病毒陽(yáng)性質(zhì)控物，購(gòu)自德國(guó)DSMZ公司，簡(jiǎn)寫(xiě)為Ar－D；1份受ArMV侵染的唐菖蒲葉片，由北京出入境檢驗(yàn)檢疫局植物檢疫實(shí)驗(yàn)室提供，簡(jiǎn)寫(xiě)為YP。3種可侵染大豆的病毒，即：番茄環(huán)斑病毒（Tomato ringspot virus，ToRSV）、煙草環(huán)斑病毒（Tobacco ringspot virus，TRSV）及南方菜豆花葉病毒（Southern bean mosaic virus，SBMV）陽(yáng)性質(zhì)控物，均購(gòu)自美國(guó)Agdia公司。1份感染菜豆莢斑駁病毒（Bean pod mottle virus，BPMV）的美國(guó)進(jìn)境大豆種子，由寧波出入境檢驗(yàn)檢疫局植物檢疫實(shí)驗(yàn)室提供。以上陽(yáng)性質(zhì)控物樣品狀態(tài)均為新鮮葉片經(jīng)液氮處理，磨成粉末狀。

1.1.2 分子生物學(xué)試劑

RNeasy Plant Mini Kit購(gòu)自 Qiagen公司，TaKa－Ra One Step RNA PCR Kit（AMV）購(gòu)自大連寶生物公司，F(xiàn)luorescent Detection Reagent、RNA Amplification Kit 購(gòu) 自 EIKEN CHEMICAL CO.，LTD.。RT－LAMP引物及 RT－PCR引物［2］由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

1.2 主要儀器

LA－320C實(shí)時(shí)濁度儀。

1.3 方法

1.3.1 總RNA的提取

分別對(duì)樣品及健康大豆［Glycine max（Linn.）Merr.］葉片，使用 RNeasy Plant Mini Kit進(jìn)行植物總RNA提取，具體操作見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。用核酸蛋白質(zhì)分析儀測(cè)A260及A280，計(jì)算核酸的濃度和純度。

1.3.2 RT－LAMP引物的設(shè)計(jì)和合成

從GenBank調(diào)出所有南芥菜花葉病毒外殼蛋白基因序列，利用DNAMAN 6.0.40軟件進(jìn)行比對(duì)分析，找出ArMV外殼蛋白基因序列的保守區(qū)，利用LAMP引物設(shè)計(jì)軟件PrimerExplorer V4（http：∥primerexplorer.jp／elamp4.0.0／index.html）設(shè)計(jì)了5組引物，其中有2組不滿足引物設(shè)計(jì)原則，再次通過(guò)對(duì)引物區(qū)段各分離物進(jìn)行同源性比對(duì)，選擇合成了其中2組（表1）。

表1 南芥菜花葉病毒RT－LAMP檢測(cè)引物Table 1 Primers used in the detection of Arabismosaicvirusby RT－LAMP

1.3.3 RT－LAMP引物的篩選

以Ar－D、YP、Ar－A總RNA為模板，健康大豆葉片總RNA為陰性對(duì)照，水為空白對(duì)照，利用各組引物進(jìn)行RT－LAMP檢測(cè)，即在25μL反應(yīng)體系中加入2μL Ar－FIP （20μmol／L），2μL Ar－BIP （20μmol／L），0.25μL Ar－F3 （20μmol／L），0.25μL Ar－B3（20μmol／L），12.5μL 2×Reaction Mix，1μL Enzyme Mix，2.5μL RNA，無(wú) RNA酶的dH2O補(bǔ)至25μL。反應(yīng)條件為：60℃60min。

1.3.4 RT－LAMP引物特異性檢測(cè)

以ToRSV、TRSV、SBMV、BPMV 和 Ar－A 總RNA為模板，按1.3.3體系和條件進(jìn)行RT－LAMP反應(yīng)。

1.3.5 靈敏度對(duì)比試驗(yàn)

以Ar－D總 RNA 為模板，用 無(wú) RNA 酶的dH2O稀釋總RNA進(jìn)行相對(duì)靈敏度檢測(cè)，在25μL反應(yīng)體系中，總 RNA分別為20ng、2ng、200pg、20pg、2pg、200fg、20fg，進(jìn)行實(shí)時(shí) RT－LAMP反應(yīng)。同時(shí)對(duì)稀釋的RNA按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行普通RTPCR檢測(cè)，即在25μL反應(yīng)體系中加入2.5μL 10×One Step RNA PCR Buffer，5μL MgCl2（25mmol／L），2.5μL dNTP Mixture （各 10mmol／L），0.5μL RNase Inhibitor（40U／μL），0.5μL AMV RTase XL（5 U／μL），0.5 μL AMV－Optimized Taq （5U／μL），0.5μL引物ArMV1［2］（20μmol／L）（5′－TGCATATAT GCAGCCCTTGTACTTA－3′），0.5μL引物 ArMV2［2］（20μmol／L）（5′－CGATGTAACACCCGGGGTATT －3′），2.5μL RNA，無(wú) RNA酶的dH2O補(bǔ)至25μL。反應(yīng)條件為：50℃30min，94℃2min；然后94℃30s，58℃30s，72℃1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃10min。PCR產(chǎn)物用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3.6 ArMV的RT－LAMP目視檢測(cè)

以Ar－D、YP、Ar－A總RNA為模板，健康大豆葉片總RNA為陰性對(duì)照，水為空白對(duì)照，進(jìn)行RTLAMP目視熒光檢測(cè)，即在25μL反應(yīng)體系中加入2μL Ar2－FIP（20μmol／L），2μL Ar2－BIP（20μmol／L），0.25μL Ar2－F3 （20μmol／L），0.25μL Ar2－B3（20μmol／L），12.5μL 2×Reaction Mix，1μL Enzyme Mix，1LFluorescent Detection Reagent，2.5μL RNA，無(wú)RNA酶的dH2O補(bǔ)至25μL。反應(yīng)條件為：60℃70min，95℃2min。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT－LAMP引物的篩選

本研究所合成的2組引物，其中Ar2組引物僅能檢出Ar－D、Ar－A分離物，Ar4組引物能檢出 Ar－D、YP和Ar－A三個(gè)分離物（圖1），故最終選擇了Ar4組引物作為ArMV RT－LAMP檢測(cè)的最佳引物（圖2）。

圖1 RT－LAMP檢測(cè)最佳引物的篩選Fig.1 Screening of the optimal primers for RT－LAMP

2.2 RT－LAMP引物特異性檢測(cè)

如圖3所示，Ar4組引物有較強(qiáng)的特異性，5種大豆病毒中僅能檢出ArMV，不能檢出ToRSV、TRSV、SBMV和BPMV，與預(yù)期結(jié)果相符。

2.3 靈敏度對(duì)比試驗(yàn)

靈敏度試驗(yàn)結(jié)果顯示，本試驗(yàn)所建立的RTLAMP檢測(cè)方法最小檢測(cè)限為20pg（圖4），與RTPCR檢測(cè)結(jié)果一致（圖5）。

2.4 ArMV的RT－LAMP目視檢測(cè)

RT－LAMP擴(kuò)增結(jié)束后，在正常光照條件下，肉眼可觀察到Ar－D、YP和Ar－A三個(gè)陽(yáng)性分離物反應(yīng)管顏色明顯變?yōu)辄S綠色，而空白對(duì)照與陰性對(duì)照反應(yīng)管顏色沒(méi)有改變（圖6）。

3 討論

目前，在LAMP反應(yīng)不開(kāi)蓋的前提下，其結(jié)果判定方式主要有目視檢查渾濁、目視檢查染料顏色變化和濁度儀對(duì)LAMP反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控這三種方法。目視檢查渾濁法主要依據(jù)LAMP反應(yīng)產(chǎn)生了大量的副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀而使反應(yīng)液呈現(xiàn)渾濁，但是當(dāng)渾濁度較低時(shí)，肉眼很難察覺(jué)。利用實(shí)時(shí)濁度儀能夠更加直觀、精確地判定結(jié)果，但是需要使用特定的儀器設(shè)備，在試驗(yàn)研究階段比較合適。目視檢查染料顏色變化主要依據(jù)反應(yīng)前體系中加入鈣黃綠素來(lái)實(shí)現(xiàn)，鈣黃綠素是一種螯合劑，反應(yīng)前與試劑中的錳離子結(jié)合處于淬滅狀態(tài)，擴(kuò)增反應(yīng)的副產(chǎn)物焦磷酸離子與錳離子結(jié)合釋放鈣黃綠素，淬滅狀態(tài)解除，發(fā)出黃綠色熒光，通過(guò)觀察熒光的有無(wú)可判斷是否有擴(kuò)增［17］。比色分析既提高了肉眼的識(shí)別率，又可直接用于現(xiàn)場(chǎng)診斷，是最為簡(jiǎn)單方便的LAMP結(jié)果判定方式，適用于成熟方法的推廣應(yīng)用。本研究利用實(shí)時(shí)濁度儀對(duì)ArMV RTLAMP檢測(cè)方法的引物進(jìn)行了優(yōu)選并進(jìn)行了特異性及靈敏度等試驗(yàn)，成功建立了南芥菜花葉病毒的RT－LAMP檢測(cè)方法，并在反應(yīng)前向反應(yīng)液中加入鈣黃綠素，陰陽(yáng)性結(jié)果顏色差別明顯，易于現(xiàn)場(chǎng)判斷。

本研究建立的ArMV實(shí)時(shí)濁度RT－LAMP檢測(cè)方法與以往檢測(cè)ArMV的方法相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)［8，13］：1、操作簡(jiǎn)單。RT－LAMP在60～65 ℃恒溫條件下進(jìn)行，不需要復(fù)雜儀器設(shè)備，只需維持恒溫的水浴鍋或金屬浴就可完成。且可通過(guò)在反應(yīng)液中加入鈣黃綠素，反應(yīng)結(jié)束后裸眼觀察顏色變化，判定結(jié)果，不需電泳儀和紫外觀測(cè)。2、特異性高。該技術(shù)通過(guò)4條引物識(shí)別靶基因6段不同的序列，在很大程度上提高了檢測(cè)的特異性。3、高效靈敏。該技術(shù)在恒溫條件下進(jìn)行，不需通過(guò)溫度循環(huán)實(shí)現(xiàn)基因擴(kuò)增，且反轉(zhuǎn)錄可與PCR一步進(jìn)行，節(jié)約了時(shí)間。60min內(nèi)DNA能擴(kuò)增到109～1010倍。其靈敏度與PCR相當(dāng)。因此，RT－LAMP技術(shù)檢測(cè)ArMV適合基層應(yīng)用，有很好的應(yīng)用前景。

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