黃有航， 譚志瓊， 王寅寒， 張榮意

（海南大學(xué)熱帶作物種質(zhì)資源保護(hù)與開發(fā)利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院，?？?570228）

橡膠樹白粉病自1918年在爪哇首次報(bào)道后，已遍及世界所有植膠園［1］，是橡膠生產(chǎn)上的重要葉部病害，危害橡膠樹新抽葉片，造成大面積落葉，嚴(yán)重影響干膠產(chǎn)量［2］。目前對(duì)白粉病的防治主要采用化學(xué)防治為主，但大量化學(xué)藥劑的使用對(duì)人畜產(chǎn)生一定的毒害且造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性。目前國(guó)內(nèi)外將芽胞桿菌作為生防因子來(lái)防治白粉病的研究主要集中在小麥白粉病和瓜類作物白粉病。宮宇飛［3］從小麥組織中分離到一株對(duì)小麥白粉病有很好防治作用的內(nèi)生芽胞桿菌E1R－J，1%的粗蛋白提取液對(duì)小麥白粉病的抑制率能夠達(dá)到86.44%，10%發(fā)酵濾液的抑制率能夠達(dá)到100%。胡莎［4］等從土壤中分離到芽胞桿菌菌株SN1、SN11，盆栽試驗(yàn)中治療效果達(dá)到83.81%、73.53%，預(yù)防效果達(dá)到91.72%、87.78%。美國(guó) Agraquest公司［5］將生防菌株枯草芽胞桿菌QST713制成生物農(nóng)藥，可以用于防治多種植物病害，是一種廣譜生物殺菌劑，其中包括防治小麥白粉病和瓜類作物白粉病。對(duì)于橡膠樹白粉病生防菌研究國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道。

枯草芽胞桿菌［Bacillus subtilis（Ehrenbery）Cohn］對(duì)多種植物真菌病害具有很好的拮抗作用，又是自然界中廣泛存在的非致病細(xì)菌，同時(shí)可以在植物體內(nèi)定殖，對(duì)人畜無(wú)害［6］。芽胞桿菌的生防機(jī)制主要是拮抗作用、誘導(dǎo)抗性、競(jìng)爭(zhēng)作用。對(duì)植物病原真菌有顯著抑制活性的主要是非核糖體合成的脂肽類抗生素。伊枯草菌素（iturin）是目前枯草芽胞桿菌拮抗物質(zhì)中研究較多的抗生素，它是枯草桿菌產(chǎn)生的一大類脂肽類化合物，包括IturinA、B、C、D、E［7－8］。其中IturinA的活性最高，它不僅對(duì)真菌有拮抗作用，對(duì)部分細(xì)菌也有拮抗效果。國(guó)外學(xué)者從枯草芽胞桿菌KS03菌種中分離到化合物伊枯草菌素A2其分子量大小1042Da［9］。

本研究從膠園土壤中分離到對(duì)橡膠樹白粉病有很好抑制作用的拮抗菌株并進(jìn)行鑒定，同時(shí)研究其在橡膠葉片上的定殖規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 供試菌株、培養(yǎng)基

橡膠粉孢（Oidium heveae B.A.Steinm.）采自海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院教學(xué)基地，采回后采用單斑分離法得到純化菌株，并保存在橡膠樹幼苗上。

分離篩選拮抗菌的培養(yǎng)基為NA培養(yǎng)基［10］。

1.2 拮抗菌的分離和篩選

從海南橡膠園取橡膠根際7～10cm土壤樣品，分別稱取5.0g置于50mL無(wú)菌水中，在200r／min搖床振蕩10min后靜置，取上清液稀釋成10－2、10－3、10－4，取20μL混合于 NA 培養(yǎng)基倒平板，30℃恒溫培養(yǎng)1d后連續(xù)挑取形態(tài)完整、差異明顯的單菌落純化后保存。

采用楊意伯［11］等的方法進(jìn)行孢子萌發(fā)試驗(yàn)和室內(nèi)盆栽試驗(yàn)，計(jì)算孢子萌發(fā)抑制率和防效。同時(shí)設(shè)置丙環(huán)唑（10% 乳油，自研，施藥濃度50μg／mL）作為防效測(cè)定的對(duì)照。

1.3 拮抗菌株的鑒定

1.3.1 拮抗菌的生理生化特性測(cè)定

參照文獻(xiàn)的方法［12］，對(duì)菌落、菌體、芽胞、鞭毛、氧化酶、硝酸鹽還原、葡萄糖氧化發(fā)酵、淀粉水解、37℃生長(zhǎng)、43℃生長(zhǎng)、明膠液化、5%NaCl生長(zhǎng)、7%NaCl生長(zhǎng)、葡萄糖產(chǎn)酸、乙酰甲基甲醇（V.P.）、pH5.7生長(zhǎng)、檸檬酸鹽、接觸酶、阿拉伯糖產(chǎn)酸、吲哚產(chǎn)生、酪氨酸分解、丙二酸鹽、厭氧生長(zhǎng)、甲基紅（M.R.）進(jìn)行測(cè)定。以枯草芽胞桿菌為對(duì)照菌［13－14］，同時(shí)進(jìn)行各性狀的測(cè)定，以驗(yàn)證方法的正確性。

1.3.2 拮抗菌株gyrB基因序列測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的gyrB 基因引物［15］UP－1s，5′－GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA－3′，引物 UP－2Sr，5′－CGGCTACCTTGTTACGACTT－3′。PCR反應(yīng)體系：2×PCR－Mixture 25μL，引物各1μL，總DNA 2μL，ddH2O 21μL，總體積50μL。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性，94℃4min；變性，94℃30s；退火，50℃30min；延伸，72℃45s；30個(gè)循環(huán)后72℃10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。將所得序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)注冊(cè)登記，應(yīng)用ClustalX比對(duì)。用軟件DNAMAN V6構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 拮抗菌抗利福平標(biāo)記

參照吳藹民的方法［16］，取20μL拮抗菌株的NB培養(yǎng)液涂在含一定量利福平的NA平板上，28℃培養(yǎng)2～3d挑取單菌落，將得到的新菌株逐級(jí)誘導(dǎo)，利福平濃度分別為1、5、10、15、20、50、100、200μg／mL和300μg／mL，直至最后篩選出抗利福平濃度為300μg／mL的突變體菌株。

1.5 抗利福平菌株耐藥穩(wěn)定性測(cè)定

參照吳勝春的方法［17］，將抗利福平菌株在 NA培養(yǎng)基上連續(xù)傳代20次后，接種到NB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，然后涂于含300μg／mL利福平的NA培養(yǎng)基上，觀察其生長(zhǎng)情況。

1.6 抗利福平菌株對(duì)橡膠樹白粉病的拮抗作用

抗利福平菌株通過(guò)孢子萌發(fā)試驗(yàn)和盆栽試驗(yàn)［11］，計(jì)算孢子萌發(fā)抑制率和防效。

1.7 抗利福平菌株在橡膠葉片上的定殖

取于30℃條件下培養(yǎng)48h的抗利福平菌株發(fā)酵液1mL，用小型噴霧器將菌液噴灑于橡膠樹淡綠葉上，使霧滴均勻地噴灑在葉面，但不形成液滴滴落，每次處理共30片葉；傷葉處理用石英砂處理橡膠淡綠葉表面后再噴灑發(fā)酵液；設(shè)無(wú)菌水為對(duì)照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，待葉片干燥后置于30℃溫室培養(yǎng)。分別在處理后1、3、5、7、10、15、20d后任取3片葉進(jìn)行標(biāo)記菌分離。

將處理后的葉片稱取1g，剪碎研磨后加入10mL無(wú)菌水混合振蕩10min，將混合液稀釋至10－3，取其中100μL均勻涂于利福平300μg／mL培養(yǎng)基平板上，30℃恒溫黑暗培養(yǎng)，24h后計(jì)數(shù)。根據(jù)每皿中的菌落數(shù)量，計(jì)算每克鮮葉片中所含的菌量，計(jì)數(shù)結(jié)果用（cfu／g）來(lái)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗細(xì)菌的分離

從海南橡膠園取橡膠根際土壤100份，分離到細(xì)菌276株，通過(guò)初篩和復(fù)篩得到拮抗效果穩(wěn)定的菌株5株。通過(guò)孢子萌發(fā)試驗(yàn)，對(duì)白粉病孢子萌發(fā)抑制率均大于70%，其盆栽試驗(yàn)防效均達(dá)到60%，其中S43的抑制效果最好，孢子萌發(fā)抑制率達(dá)到86.34%，防效達(dá)到86.54%，對(duì)白粉病的防效和丙環(huán)唑比較無(wú)顯著差異，見表1。因此本文選取S43進(jìn)行進(jìn)一步研究。

表1 5株拮抗菌對(duì)白粉病的拮抗效果1）Table 1 Antagonistic efficacy of five antagonistic bacterial strains to the powdery mildew

2.2 拮抗菌株S43的鑒定

2.2.1 菌體特征和菌落特征

在NA平板上S43菌落白色，圓形，邊緣不整齊，表面有皺紋。菌體呈桿狀，周生鞭毛，革蘭氏染色陽(yáng)性，產(chǎn)芽胞，芽胞橢圓形、中生、不膨大。

2.2.2 生理生化特性測(cè)定結(jié)果

拮抗菌株S43的生理生化特征測(cè)定結(jié)果如表2所示。

表2 S43主要生理生化特征1）Table 2 Main physiological and biochemical features of the strain S43

2.2.3 gyrB基因序列分析

將S43的促旋酶（gyrase）的B亞單位基因序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，序列大小為1201bp，將得到的序列與芽胞桿菌屬菌株做BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與其同源性較高的菌株為枯草芽胞桿菌（見圖1）。

圖1 S43系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of the strain S43

綜合形態(tài)特征、生理生化特征和gyrB基因序列分析，對(duì)照文獻(xiàn)［13－14，18－19］，將該菌株鑒定為枯草芽胞桿菌。

2.3 抗利福平菌株的獲得及耐藥穩(wěn)定性測(cè)定

將抗利福平篩選獲得的菌株在NA平板上培養(yǎng)20代后，用牙簽任意挑取單菌落，接種于含利福平300μg／mL培養(yǎng)基上培養(yǎng)，均能正常生長(zhǎng)，說(shuō)明標(biāo)記菌株具有很好耐藥穩(wěn)定性。將利福平誘導(dǎo)獲得的菌株編號(hào)為S43＊。

2.4 菌株S43＊對(duì)橡膠樹白粉病的拮抗作用

孢子萌發(fā)試驗(yàn)和盆栽試驗(yàn)表明，S43＊對(duì)白粉病孢子萌發(fā)抑制率為85.00%，防效為86.12%，拮抗效果基本與原始菌株S43接近。

2.5 菌株S43＊在橡膠葉片上的定殖與消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)

對(duì)橡膠葉片進(jìn)行傷葉和不傷葉處理均能分離到標(biāo)記菌株，對(duì)照未出現(xiàn)任何細(xì)菌菌落，說(shuō)明標(biāo)記菌株S43＊能在橡膠葉片上定殖。

兩種處理標(biāo)記菌株在橡膠葉片的定殖動(dòng)態(tài)如圖2所示，接種后第1天葉片上的標(biāo)記菌量達(dá)到最大，傷葉處理定殖量要比不傷葉處理定殖量大一倍，隨著時(shí)間的推移標(biāo)記菌株的定殖數(shù)量持續(xù)下降，在接種后第1天到接種后第5天，菌量下降最快，接種10d后，菌量下降速率變慢，接種后15d菌量開始保持穩(wěn)定。

圖2 傷葉和不傷葉處理標(biāo)記菌株S43＊在葉片上的定殖動(dòng)態(tài)Fig.2 Colonization dynamics of the marked strain S43＊ on injured and non－injured leaves

3 結(jié)論與討論

gyrB即促旋酶（gyrase）的B亞單位基因，是編碼DNA負(fù)超螺旋的拓?fù)洚悩?gòu)酶—DNA促旋酶的B亞單位蛋白［20］。由于16SrDNA具有高度保守性，且分子量小，包含信息小，對(duì)于親緣較近的菌屬，分辨率不高。gyrB基因存在于大多數(shù)細(xì)菌中，且不會(huì)發(fā)生頻繁的水平轉(zhuǎn)移，在不同的蛋白及蛋白的不同位點(diǎn)，其氨基酸替代率也不相同。因此gyrB基因可以應(yīng)用于細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)，特別是在近緣種區(qū)分及鑒定。

本試驗(yàn)從橡膠根際土壤中篩選到一株對(duì)橡膠白粉病有較好拮抗作用的菌株S43，根據(jù)形態(tài)特征、生理生化特征并結(jié)合gyrB基因序列比對(duì)，將S43菌株鑒定為枯草芽胞桿菌。

作為生防菌株，應(yīng)該選擇定殖速度快、定殖量大、營(yíng)養(yǎng)需求低、存活能力強(qiáng)、存活時(shí)間久的有益微生物。生防菌株在植物體內(nèi)定殖是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，受諸多因素的影響。除了菌株本身原因外，植物組織結(jié)構(gòu)、外部環(huán)境的不同都對(duì)定殖產(chǎn)生影響。對(duì)定殖規(guī)律的深入研究，揭示定殖過(guò)程中諸多影響因子，有助于生防菌更好地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上［21］。

本試驗(yàn)對(duì)標(biāo)記菌株S43＊進(jìn)行定殖規(guī)律研究，研究表明，標(biāo)記菌株S43＊能在橡膠葉片上較好地定殖。在接種后第1天，菌量達(dá)到最大，但隨著時(shí)間的推移，菌量逐漸減少，接種15d后，菌量基本保持穩(wěn)定。傷葉接種和不傷葉接種10d以后葉片標(biāo)記菌量相差不多。其中傷葉處理在接種初期葉片標(biāo)記菌的定殖量要高于不傷葉處理，但隨著時(shí)間推移，兩種處理葉片上最終定殖菌量相差不多。自然定殖的芽胞桿菌的數(shù)量，涉及橡膠葉片上微生態(tài)學(xué)的研究，不是本論文的研究重點(diǎn)，我們的拮抗芽胞桿菌含有利福平抗性標(biāo)記，自然定居的芽胞桿菌不影響本研究的結(jié)果。

寄主表面存在傷口，傷口成為細(xì)菌入侵的通道，傷口滲出物成為細(xì)菌生存的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而促進(jìn)細(xì)菌的定殖，故傷葉處理比不傷葉處理定殖率要高。但是由于寄主本身生理學(xué)性狀會(huì)決定其內(nèi)部環(huán)境中生存的種群數(shù)量大小，且侵入細(xì)菌會(huì)與植物內(nèi)部已定殖的其他微生物之間存在競(jìng)爭(zhēng)、拮抗、互利等諸多關(guān)系，最終會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)菌群數(shù)量趨于穩(wěn)定。

本研究所采用的分離標(biāo)記菌株的方法，只能分離耐藥性的菌株，并不能證明兩株標(biāo)記菌株是橡膠葉片上的內(nèi)生細(xì)菌。對(duì)于這兩株是否可以作為內(nèi)生細(xì)菌，需進(jìn)一步研究。

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