孟 翔， 胡俊杰， 冀衛(wèi)榮， 劉賢謙＊

（1.廣東省昆蟲研究所，廣州 510260；2.廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510006；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，太谷 030801）

植物是生物活性化合物的天然寶庫，其產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物超過40萬種［1］，其中許多次生化學(xué)物質(zhì)具有殺蟲和（或）抑菌等生物活性［2］，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥上有著重要的研究價(jià)值。此外，植物源農(nóng)藥的活性成分除受自身遺傳因子控制外、還受外界環(huán)境條件（如土壤、溫度、光照、土壤pH值）的影響，及有地域性和季節(jié)性等變化［3－4］。所以，植物源農(nóng)藥穩(wěn)定性的好壞將對新型農(nóng)藥的開發(fā)和有效利用產(chǎn)生重要影響。

萬壽菊（Tagetes eracta Linn.）為一年生草本植物，廣泛分布于全國各地，是近年來研究較多的殺蟲植物之一。目前對于萬壽菊生物活性研究對象多集中于害蟲的防治，而關(guān)于萬壽菊抑菌活性的研究則相對較少，目前報(bào)道的主要是農(nóng)作物真菌性病害［5］。棗（Ziziphus jujuba Mill.）縮果病是近年來我國北方棗區(qū)發(fā)生的一種病害，常暴發(fā)流行，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［6］。目前研究報(bào)道的棗縮果病病原菌主要有細(xì)交鏈孢菌［Alternaria alternata（Fr.）Keissler］、聚生小穴殼菌（Dothiorella gregaria Sacc.）、橄欖色盾殼霉菌（Coniothyrium olivaceumBon.）和一種細(xì)菌［7－8］。在山西壺瓶棗縮果病主要的致病真菌中也包括細(xì)交鏈孢菌［9］。本實(shí)驗(yàn)室已通過研究萬壽菊根不同溶劑提取物對棗縮果病病原菌的抑菌活性，篩選出最佳粗提物－－乙酸乙酯粗提取物［6］，其對細(xì)交鏈孢菌的抑菌活性最高。但該提取物能否在田間防治棗縮果病中保持穩(wěn)定的防效還未曾研究報(bào)道。為進(jìn)一步研究該提取物在棗縮果病防治中的應(yīng)用潛力，作者對萬壽菊根乙酸乙酯粗提物對棗縮果病病原菌的抑菌效果作進(jìn)一步研究，并對其不同條件下的穩(wěn)定性進(jìn)行了測定，以期為開發(fā)經(jīng)濟(jì)、安全、高效的萬壽菊殺菌劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物材料

萬壽菊根采自山西太谷陽邑鄉(xiāng)回馬村。采集時(shí)間2006年秋。將萬壽菊根洗凈、陰干，55℃烘干，粉碎機(jī)粉碎過60目篩，備用。

1.1.2 供試菌種

棗縮果 病 病 原 菌［7－8］：細(xì) 交 鏈 孢 菌 ［Alternaria alternata（Fr.）Keissler］為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

1.1.3 試劑及儀器

乙酸 乙 酯 （分 析 純）、1mol／L HCl、1mol／L NaOH。

恒溫水浴鍋，250mL的具塞三角瓶，25mL具塞試管，2mL封口離心管。

1.2 方法

1.2.1 萬壽菊根乙酸乙酯粗提取物的提取

振蕩法［10］：稱取10g萬壽菊根粉，置于250mL的具塞三角瓶中，加入5倍體積的乙酸乙酯，常溫25℃下振蕩浸提3次，3次濾液合并后減壓濃縮，直至呈浸膏狀。試驗(yàn)重復(fù)3次，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 萬壽菊根乙酸乙酯粗提取物抑菌物質(zhì)穩(wěn)定性測定

以萬壽菊根乙酸乙酯粗提物為供試樣品，以細(xì)交鏈孢菌為指示菌，無藥劑培養(yǎng)基為對照，采用菌絲生長測定法測量菌落直徑，并計(jì)算抑制率，重復(fù)3次。

菌絲生長測定［11］：取定量的提取物，以2～3滴吐溫80做乳化劑并稀釋為EC500.36mg／mL的濃度［5］，作為處理藥劑，倒入直徑9cm的培養(yǎng)皿中，與PDA培養(yǎng)基（1mL∶9mL）混合均勻備用。用6mm直徑的打孔器從培養(yǎng)純化好的菌種中采菌，用接種針接入藥劑培養(yǎng)基中，并做空白對照。在25℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用十字交叉法記錄菌絲生長直徑，計(jì)算相對抑制率。重復(fù)3次。

1.2.2.1 熱穩(wěn)定性試驗(yàn)［12］

取樣品18份，分別放入25mL的具塞試管中，設(shè)對照、未做任何處理的粗提取物（原藥），其余16份分別在40、70、100℃水浴中及高壓滅菌鍋中加熱（121℃），分別于10、30、60、120min取出，待自然冷卻后檢測活性。

1.2.2.2 光穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品6份分別放入25mL的具塞試管中，設(shè)對照、未做任何處理的粗提取物（原藥），其余4份分別在自然光下照射6、12、18、24h，檢測活性。

1.2.2.3 紫外照射穩(wěn)定性試驗(yàn)［13］

取樣品6份，分別放入25mL的具塞試管中，設(shè)對照、未做任何處理的粗提取物（原藥），其余4份分別置于超凈工作臺(tái)內(nèi)懸掛的30W（輻射強(qiáng)度90μ W／cm2）紫外線殺菌燈管下距離40cm處10、20、30、60min，檢測活性。

1.2.2.4 酸堿穩(wěn)定性試驗(yàn)［12－14］

取樣品11份分別放入25mL的具塞試管中，設(shè)對照、未做任何處理的粗提取物（原藥），其余9份用1mol／L HCl、1mol／L NaOH 將樣品分別調(diào)成pH3～12，然后將每份調(diào)好的樣品分裝成3個(gè)試管，每管1mL，即得到3組pH為3～12的樣品，之后進(jìn)行如下處理：

①第一組樣品：室溫（25±5℃）下放置2d，檢測活性。

②第二組樣品分別于60℃水浴加熱，30、60、120min取樣，取出后迅速冷卻至室溫，檢測活性。

③第三組樣品：分別于100℃水浴加熱，30、60、120min取樣，取出后迅速冷卻至室溫，檢測活性。

1.2.2.5 耐儲(chǔ)藏性試驗(yàn)［12］

將樣品放在2mL封口離心管中，分別在－20、4、25、50℃的恒溫條件下保存30d和120d后檢測活性。

1.3 分析方法

利用EXCEL和DPS7.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、方差分析、多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱穩(wěn)定性

將萬壽菊乙酸乙酯粗提取物分別在40、70、100℃水浴中加熱和高溫滅菌10、30、60、120min后，粗提取物對細(xì)交鏈孢菌菌落抑制表現(xiàn)各不相同。由圖1所知：在40、70、100℃的加熱處理中，同一處理時(shí)間，溫度的升高對粗提取物的抑菌活性無明顯影響。但短時(shí)間的溫度提升（10min）可以提高粗提取物的抑菌活性，菌落平均抑制率為（84.29±1.35）%，較原藥（73.27±1.31）%的抑菌活性高。隨著粗提取物加熱處理時(shí)間的延長，抑菌作用緩慢降低。不同時(shí)間高溫滅菌（121℃）處理的粗提取物的抑菌活性均低于40～100℃不同時(shí)間處理和原藥的抑菌活性，且降低明顯。

圖1 萬壽菊乙酸乙酯粗提取物熱穩(wěn)定性Fig.1 The heat stability of T.eractaethyl acetate extract

2.2 光穩(wěn)定性

將萬壽菊乙酸乙酯粗提取物在自然光下照射6、12、18、24h后，其抑菌活性隨光照時(shí)間的增加而增強(qiáng)，光照6、12、18、24h的萬壽菊乙酸乙酯粗提取物對細(xì)交鏈孢菌菌落的抑制率分別為：（70.55±0.26）%，（72.95±1.24）%，（74.45±2.38）%，（74.70±0.98）%，較原藥（70.28±3.47）%的抑菌活性高（圖2）。

2.3 紫外照射穩(wěn)定性

萬壽菊乙酸乙酯粗提取物不受紫外光照時(shí)（即原藥），對細(xì)交鏈孢菌的抑制作用最小，抑制率為（73.27±3.47）%，隨著紫外光照時(shí)間的增加，抑制率也很快升高，到紫外光照60min時(shí)，萬壽菊乙酸乙酯粗提取物抑制作用達(dá)（79.75±0.35）%（圖3）。這與上述自然光照引起萬壽菊乙酸乙酯粗提取物抑菌活性增強(qiáng)結(jié)果一致。

2.4 酸堿穩(wěn)定性

在相同溫度條件下，當(dāng)萬壽菊乙酸乙酯粗提取物pH為7～8時(shí)，其對細(xì)交鏈孢菌的抑制活性較在其他pH條件下高，且與原藥抑制率（75.32±1.25）%相接近，無顯著性差異；隨著乙酸乙酯粗提取物酸堿性的增強(qiáng)，其抑制率逐漸降低。在不同溫度條件下，同一pH的乙酸乙酯粗提取物對細(xì)交鏈孢菌的抑制率大小順序?yàn)槭覝?d＞60℃＞100℃。在同一溫度下（60℃，100℃），粗提取物隨加熱時(shí)間的增長，抑菌活性降低。差異顯著性分析表明：當(dāng)pH為7～8時(shí)，在60℃條件下加熱處理30min的粗提取物對細(xì)交鏈孢菌抑制率相對較高，為（76.13±0.18）%和（75.67±1.95）%（表1）。

2.5 耐儲(chǔ)藏性

萬壽菊乙酸乙酯粗提取物在不同溫度條件下保存對細(xì)交鏈孢菌的抑菌活性表現(xiàn)各不相同，由圖4可知：隨著儲(chǔ)存溫度的升高，粗提取物抑菌活性逐漸降低。其中，在25、50℃的恒溫條件下保存30d和120d的粗提取物抑菌活性降低明顯，保存30d抑制率分別為（66.32±3.73）%、（52.28±1.98）%。120d抑制率分別為（39.22±1.00）%、（33.72±1.14）%；在－20、4℃下保存30d抑菌活性無顯著性變化，其抑制率為（73.5±3.82）%、（72.81±2.51）%；將保存時(shí)間延長至120d，前者抑制率為（73.22±2.91）%，后者為（69.3±4.75）%，無顯著差異。

表1 萬壽菊乙酸乙酯粗提取物酸堿穩(wěn)定性1）Table 1 The acid and alkaline stability of T.eractaethyl acetate extract

圖4 不同溫度保存對萬壽菊乙酸乙酯粗提取物穩(wěn)定性的影響Fig.4 The effects of storage temperature on the stability of T.eractaethyl acetate extract

3 結(jié)論與討論

從天然資源中尋找活性物質(zhì)代替化學(xué)農(nóng)藥，開發(fā)新型的“環(huán)境和諧農(nóng)藥”已成為當(dāng)前農(nóng)藥研究的重點(diǎn)，特別是在果樹、蔬菜以及農(nóng)產(chǎn)品貯藏等的病害防治中顯得尤為重要，而植物源農(nóng)藥則是新農(nóng)藥開發(fā)的重要途徑之一。萬壽菊在我國資源豐富，并不斷在農(nóng)業(yè)病蟲害防治中得到廣泛研究和應(yīng)用，研究發(fā)現(xiàn)，萬壽菊根乙酸乙酯提取物對棗縮果病三種病原菌均具有較高的毒力［5］。可見，萬壽菊不僅在農(nóng)業(yè)病害防治中具有抗菌活性［15－16］，在棗樹病害防治方面也具有廣譜抗菌活性，這也預(yù)示著萬壽菊在果樹病害防治方面具有潛在的開發(fā)利用價(jià)值。

穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，萬壽菊乙酸乙酯粗提取物的熱穩(wěn)定性良好，但耐高溫性相對較差，在自然光照和紫外光照射條件下，不發(fā)生分解，且與眾多報(bào)道的萬壽菊粗提取物具有光活化殺蟲活性結(jié)果［17］相一致，光照可能改變了萬壽菊粗提取物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，提高了生物活性，從而抑制效果明顯增強(qiáng)。這也證實(shí)了萬壽菊根提取物經(jīng)光照后，不僅在殺蟲應(yīng)用中具有較好的光活化作用，在抑菌作用中也同樣具有較強(qiáng)的光活化作用。但其有效的抑菌成分是否與曾報(bào)道的萬壽菊提取物的光活化殺蟲活性主要依賴其所含的α－三連噻吩［18］成分相同還有待做深入研究。在酸堿環(huán)境下，當(dāng)pH為7～8時(shí)，各條件粗提取物對細(xì)交鏈孢菌的抑制率相對較高；不同溫度處理的粗提取物抑菌作用變化趨勢是：室溫下放置2d后＞60℃＞100℃，但在60℃條件下加熱處理30min的粗提取物對細(xì)交鏈孢菌抑制率相對較高，與熱穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果一致。說明一定的溫度和時(shí)間能提高粗提取物的抑菌活性。酸堿穩(wěn)定性研究結(jié)果還顯示：偏強(qiáng)酸和強(qiáng)堿性環(huán)境的粗提取物對細(xì)交鏈孢菌的抑制作用下降，當(dāng)pH＝3和pH＝12時(shí)，結(jié)果顯示粗提取物的抑菌活性較高，這可能是強(qiáng)酸強(qiáng)堿使粗提取物失活，直接作用導(dǎo)致抑菌率較高。而實(shí)際經(jīng)強(qiáng)酸或強(qiáng)堿處理后的粗提取物本身的抑菌性能減小。此外，萬壽菊乙酸乙酯粗提取物抑菌活性物質(zhì)在4℃以下的低溫條件下儲(chǔ)藏穩(wěn)定性較好，而高溫條件下易損失活性物質(zhì)。符合低溫耐儲(chǔ)藏規(guī)律。

由此我們得出開發(fā)、利用和儲(chǔ)藏萬壽菊乙酸乙酯粗提取物的最佳條件是：不能使用高溫滅菌的方法避免提取物雜菌滋生，且儲(chǔ)存溫度不宜太高，4℃條件以下最好，儲(chǔ)存時(shí)間不能過久，使用時(shí)不需要避自然光和紫外光，環(huán)境pH應(yīng)保持在7～8左右。盡管這樣可以降低粗提物活性減低的速度，但最好能盡快使用。

本試驗(yàn)僅限于在實(shí)驗(yàn)室離體研究，萬壽菊根提取物對棗縮果病病原菌有效抑菌活性成分及作用機(jī)理等還有待做進(jìn)一步的萃取和柱層析分離研究，其在田間試驗(yàn)中是否具有穩(wěn)定的防效，能否在田間棗園廣泛應(yīng)用還需做具體環(huán)境的考察和試驗(yàn)驗(yàn)證。

［1］ Swain T.Secondary compounds of protective agents［J］.Annual Review of Plant Physiology，1997，28：479 －501.

［2］ 趙善歡，萬樹青.殺蟲植物的研究及應(yīng)用進(jìn)展［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，1997（1）：26－28.

［3］ 劉長令，李正名.以天然產(chǎn)物為先導(dǎo)化合物開發(fā)的農(nóng)藥品種（Ⅰ）［J］.農(nóng)藥，2003，42（11）：1－4.

［4］ 徐漢虹.殺蟲植物與植物性殺蟲劑［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001：22－26.

［5］ 孟翔，劉賢謙，胡俊杰，等.萬壽菊根不同溶劑提取物對棗縮果病病原菌抑菌活性研究［J］.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，28（3）：283－286.

［6］ 張鋒，李英梅，李瑞婷，等.棗樹縮果病空間分布格局和抽樣技術(shù)研究［J］.植物保護(hù)，2010，36（4）：123－126.

［7］ 鄭曉蓮，齊秋鎖，趙光耀，等.棗縮果病病原子實(shí)體誘導(dǎo)和鑒定［J］.植物保護(hù)，1996，22（6）：6－8.

［8］ 周琳，宋宏偉，于磊，等.棗縮果病研究進(jìn)展［J］.河南林業(yè)科技，2002，22（1）：21－22.

［9］ 徐祥彬，賴童飛，景云飛，等.山西壺瓶棗縮果病病原菌分離和鑒定［J］.植物病理學(xué)報(bào)，2009，39（3）：225－230.

［10］楊順義，郭東艷，張新虎，等.瑞香狼毒根中抑菌成分提取工藝［J］.農(nóng)藥，2006，45（9）：595－596.

［11］方中達(dá).植病研究方法［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998：11－12.

［12］ 隋勤，劉偉成，劉霆，等.利迪鏈霉A02的抑菌譜及其抑菌活性的穩(wěn)定性［J］.植物保護(hù)，2007，33（5）：67－71.

［13］王杰，張名位，劉興華.苦瓜提取物的抑菌作用及其穩(wěn)定性研究［J］.食品添加劑，2004（4）：54－56.

［14］王南舟，鐘立人.魚精蛋白抗菌特性的研究［J］.食品科學(xué)，2000，21（4）：43－46.

［15］李文英，劉賢謙，戴建青，等.萬壽菊粗提物的抑菌作用初探［J］.農(nóng)藥，2002，41（10）：41－42.

［16］王文斌，郭春絨.萬壽菊根不同溶劑提取物對辣椒枯萎病菌的抑制作用［J］.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，24（4）：407－410.

［17］王新國，徐漢虹，趙善歡.殺蟲植物萬壽菊的研究進(jìn)展［J］.西安聯(lián)合大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，5（2）：5－10.

［18］樂海洋，趙善歡.萬壽菊提取物對白紋伊蚊幼蟲的光活化活性及有效成分研究［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，19（2）：8－12.