柳永娥， 李惠霞＊， 馬金慧， 楊成德， 張廣榮

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中－美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，蘭州 730070；2.甘肅省白銀市植保站，白銀 730900）

根結(jié)線蟲(chóng)是一種永久性的內(nèi)寄生病原線蟲(chóng)，能夠?qū)υS多作物造成嚴(yán)重?fù)p害，具有廣泛的地理分布和寄主范圍，一旦侵入，會(huì)在土壤中長(zhǎng)期存在，難以根除［1］。北方保護(hù)地蔬菜的種植為其創(chuàng)造了良好的寄生條件，使其在北方保護(hù)地中的傳播和危害日益嚴(yán)重。甘肅省白銀市保護(hù)地蔬菜種植面積廣，僅白銀區(qū)設(shè)施蔬菜種植面積達(dá)1980hm2，蔬菜種植種類(lèi)主要為番茄、黃瓜、豇豆、茄子等，都是根結(jié)線蟲(chóng)的良好寄主。由于多年連作，或上述蔬菜之間輪作，使得根結(jié)線蟲(chóng)的防治更加困難，根結(jié)線蟲(chóng)已成為白銀市具有重要經(jīng)濟(jì)性的病原線蟲(chóng)。由于線蟲(chóng)不同的種間存在顯著的致病性差異，因此根結(jié)線蟲(chóng)種的鑒定是防治的基礎(chǔ)，本文通過(guò)形態(tài)學(xué)結(jié)合同工酶測(cè)定對(duì)白銀市保護(hù)地蔬菜主要種植區(qū)的根結(jié)線蟲(chóng)種類(lèi)進(jìn)行了鑒定，以期為防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲(chóng)源

2012年5月－7月在白銀市保護(hù)地蔬菜主要種植區(qū)靖遠(yuǎn)縣平堡鄉(xiāng)、東灣鎮(zhèn)、北灣鄉(xiāng)和白銀區(qū)強(qiáng)灣鄉(xiāng)、水川鎮(zhèn)及平川區(qū)寶積鄉(xiāng)等采集了番茄、黃瓜、豇豆等幾種蔬菜的根結(jié)線蟲(chóng)病根樣（如表1所示），帶回實(shí)驗(yàn)室，直接解剖獲得雌蟲(chóng)，備用。其余病根樣4℃保存。

表1 白銀市蔬菜根結(jié)線蟲(chóng)樣本采集信息Table 1 Information of root－knot nematode samples collected from greenhouse vegetables in Baiyin City

1.2 會(huì)陰花紋的制作

參考馮志新的方法制作會(huì)陰花紋［2］，會(huì)陰花紋制作好后在Nikon顯微鏡下觀察并拍照，初步判斷根結(jié)線蟲(chóng)的種類(lèi)。

1.3 同工酶分析

1.3.1 兩種同工酶的提取

酶浸提液為質(zhì)量濃度20%蔗糖和2%Triton－100［3］，每個(gè)種群分別制作5條雌蟲(chóng)和單條雌蟲(chóng)的酶浸提液樣，每樣重復(fù)3次，5條雌蟲(chóng)加入50μL酶浸提液，單條雌蟲(chóng)加入20μL，然后用自制尖頭磨面玻璃棒研碎雌蟲(chóng)，－20℃過(guò)夜使用或冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 電泳

采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳儀為DYY－5型，垂直板電泳槽為DYCZ－30型，凝膠板大小105mm×185mm，凝膠厚度1mm。分離膠和濃縮膠濃度分別為7.5%和3%，電極緩沖液為pH8.3的Tris－甘氨酸緩沖液。用20μL移液槍加樣，每孔加15μL樣品和5μL 1%溴酚藍(lán)溶液，80V下電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)兩膠邊界，120V電泳至溴酚藍(lán)距底部1cm處，結(jié)束電泳。

1.3.3 染色

參考陳永芳等的方法［4］染色。電泳結(jié)束后，取下凝膠，在37℃黑暗條件下染色，蘋(píng)果酸脫氫酶（MDH）染色8～10min，酯酶（EST）染色30min。染色完畢后，蒸餾水沖洗干凈，立即用10%的醋酸溶液固定1～3h，后用蒸餾水沖洗干凈，并拍照保存。根據(jù)染色結(jié)果判讀MDH和EST譜型，參照Esbenshade和 Triantaphyllou［4］的根結(jié)線蟲(chóng)酯酶和蘋(píng)果酸脫氫酶的電泳譜型標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算兩種酶的相對(duì)遷移率（Rf值），確定根結(jié)線蟲(chóng)的種類(lèi)。

2 結(jié)果與分析

2.1 會(huì)陰花紋的觀察

試驗(yàn)結(jié)果表明，靖遠(yuǎn)縣6個(gè)根結(jié)線蟲(chóng)群體和白銀區(qū)、平川區(qū)10個(gè)根結(jié)線蟲(chóng)群體的會(huì)陰花紋基本一致，具有如圖1所示的特征（圖1a、b），背弓高而方，線紋大多平滑，亦有波浪狀線紋，無(wú)側(cè)線。初步鑒定為南方根結(jié)線蟲(chóng)。

靖遠(yuǎn)縣8個(gè)根結(jié)線群體和白銀區(qū)1個(gè)根結(jié)線蟲(chóng)群體會(huì)陰花紋形態(tài)相似，背弓低圓或略高，線紋平滑，兩條側(cè)線明顯，從尾區(qū)向外延伸，略呈“八”字形或基本在同一水平線上，有些尾端有明顯的“渦”，如圖1c、d所示。初步鑒定為爪哇根結(jié)線蟲(chóng)。

圖1 白銀市蔬菜根結(jié)線蟲(chóng)群體雌蟲(chóng)會(huì)陰花紋形態(tài)圖Fig.1 Illustration of perineal patterns of root－knot nematode populations on vegetables in Baiyin City

2.2 同工酶測(cè)定

經(jīng)同工酶電泳圖譜觀察，采自白銀市的25個(gè)蔬菜根結(jié)線蟲(chóng)群體的蘋(píng)果酸脫氫酶無(wú)論是多雌樣品還是單雌樣品表型完全一致，均為N1型（圖2、圖3），Rf值為0.24。酯酶圖譜觀察結(jié)果顯示，靖遠(yuǎn)縣6個(gè)根結(jié)線蟲(chóng)群體和白銀區(qū)、平川區(qū)10個(gè)根結(jié)線蟲(chóng)群體多雌樣和單雌樣的酯酶圖譜具有一致的表型，均為I1型（圖2），Rf值為0.44，而其他8個(gè)靖遠(yuǎn)縣根結(jié)線群體和1個(gè)白銀區(qū)根結(jié)線蟲(chóng)群體酯酶圖譜一致為J3型（圖3），Rf值分別為0.44、0.52、0.56。

圖2 南方根結(jié)線蟲(chóng)的同工酶表型Fig.2 MDH－EST phenotypes of single females of M.incognita

圖3 爪哇根結(jié)線蟲(chóng)的同工酶表型Fig.3 MDH－EST phenotype of single females of M.javanica

將以上酯酶和蘋(píng)果酸脫氫酶譜型觀察結(jié)果和Rf值測(cè)量結(jié)果與Esbenshade和Triantaphyllou［4］的根結(jié)線蟲(chóng)酯酶和蘋(píng)果酸脫氫酶的電泳譜型標(biāo)準(zhǔn)相比較，將靖遠(yuǎn)縣的6個(gè)群體鑒定為南方根結(jié)線蟲(chóng)，8個(gè)群體鑒定為爪哇根結(jié)線蟲(chóng)，白銀區(qū)和平川區(qū)的10個(gè)群體為南方根結(jié)線蟲(chóng)，1個(gè)群體為爪哇根結(jié)線蟲(chóng)。此判定結(jié)果與會(huì)陰花紋的鑒定結(jié)果一致，且每一群體均為單一群體，同一個(gè)大棚或溫室中無(wú)復(fù)合侵染現(xiàn)象。

3 討論

本研究利用形態(tài)學(xué)鑒定與同工酶技術(shù)相結(jié)合的方法鑒定出白銀市部分蔬菜根結(jié)線蟲(chóng)群體為爪哇根結(jié)線蟲(chóng)，部分群體為南方根結(jié)線蟲(chóng)。這是首次在甘肅省發(fā)現(xiàn)爪哇根結(jié)線蟲(chóng)。爪哇根結(jié)線蟲(chóng)因其具有典型的會(huì)陰花紋特征和酯酶譜帶類(lèi)型，在鑒定中僅依據(jù)這兩個(gè)特征就可達(dá)到準(zhǔn)確鑒定的目的。Esbenshade和Triantaphyllou曾證明有94%的北方根結(jié)線蟲(chóng)，98%的南方根結(jié)線蟲(chóng)及100%的爪哇根結(jié)線蟲(chóng)僅依據(jù)其酯酶譜帶就能確定其種類(lèi)［4］，且現(xiàn)已證實(shí)根結(jié)線蟲(chóng)種的酯酶譜帶特異性很穩(wěn)定，可以用于4種常見(jiàn)根結(jié)線蟲(chóng)的鑒定。自2002年劉培磊首次在普通的電泳設(shè)備上實(shí)現(xiàn)單個(gè)雌蟲(chóng)蘋(píng)果酸脫氫酶和酯酶兩種同工酶的分離以來(lái)［5］，已有眾多研究者將其應(yīng)用于根結(jié)線蟲(chóng)的鑒定中，這為根結(jié)線蟲(chóng)的快速鑒定奠定了基礎(chǔ)。

南方根結(jié)線蟲(chóng)（M.incognita）、花生根結(jié)線蟲(chóng)（M.arenaria）、爪哇根結(jié)線蟲(chóng)（M.javanica）和北方根結(jié)線蟲(chóng)（M.hapla）是引起蔬菜根結(jié)線蟲(chóng)的主要病原［6］，據(jù)相關(guān)報(bào)道南方根結(jié)線蟲(chóng)是危害我國(guó)蔬菜的優(yōu)勢(shì)種群［7－12］。在甘肅省蔬菜根結(jié)線蟲(chóng)的報(bào)道中，高赟、漆永紅等通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定出南方根結(jié)線蟲(chóng)是危害河西地區(qū)番茄和黃瓜的病原［13－14］。由于根結(jié)線蟲(chóng)不同種之間存在顯著的致病性差異［15］，因此準(zhǔn)確鑒定根結(jié)線蟲(chóng)種類(lèi)是防治的前提。甘肅省蔬菜根結(jié)線蟲(chóng)種類(lèi)研究尚不全面，目前報(bào)道的只有河西地區(qū)的線蟲(chóng)種類(lèi)，甘肅省氣候條件和地理環(huán)境差異很大，其他地區(qū)的根結(jié)線蟲(chóng)群體還有待于進(jìn)一步的鑒定。樣品的快速鑒定顯得尤為重要，通過(guò)蛋白質(zhì)凝膠電泳進(jìn)行蘋(píng)果酸脫氫酶和酯酶的測(cè)定不失為一種簡(jiǎn)便、快速的鑒定方法，會(huì)陰花紋結(jié)合同工酶測(cè)定與單純的形態(tài)學(xué)鑒定相比更為準(zhǔn)確和可靠。

［1］ Roberts P A，Matthews W C，Ehlers J D.Genetic determinants of differential resistance to root－knot nematode reproduction and galling in lima bean［J］.Crop Science，2008，48（2）：553.

［2］ 馮志新.植物線蟲(chóng)學(xué)［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2001：170－176.

［3］ 卓侃，胡茂秀，王宏洪，等.高爾夫果嶺草上禾本科根結(jié)線蟲(chóng)的鑒定［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2011，20（1）：253－256.

［4］ 陳永芳，吳建宇，胡先奇，等.用PhastSystem電泳儀快速鑒定根結(jié)線蟲(chóng)種類(lèi)［J］.植物病理學(xué)報(bào)，1998，28（1）：73－77.

［5］ 劉培磊.中國(guó)根結(jié)線蟲(chóng)群體的同工酶表型和線粒體DNA多態(tài)性分析［D］.南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2002.

［6］ Schmitz B，Burgermeister W，Braasch H.Molecular genetic classification of central European Meloidogyne chitwoodi and M.fallax populations［J］.Nachrichtenblatt.des Deutschen Pflanzenschutzdienstes，1998，50（12）：310－317.

［7］ 王仁剛，簡(jiǎn)恒，向紅瓊，等.北京地區(qū)保護(hù)地蔬菜跟結(jié)線蟲(chóng)種類(lèi)鑒定［J］.植物保護(hù)，2007，33（3）：90－92.

［8］ 秦公偉，李麗霞，王富，等.漢中蔬菜根結(jié)線蟲(chóng)種類(lèi)的同工酶酶譜鑒定［J］.陜西理工學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，25（4）：37－39.

［9］ 張靠穩(wěn)，賈振華.寧夏賀蘭山農(nóng)牧場(chǎng)黃瓜根結(jié)線蟲(chóng)種類(lèi)鑒定［J］.北方園藝，2008（2）：220－222.

［10］樊穎倫，張維國(guó)，呂山花，等.山東保護(hù)地蔬菜根結(jié)線蟲(chóng)種類(lèi)鑒定［J］.華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2009（S1）：262－264.

［11］毛琦，張榮，張小艷，等.陜西省溫室蔬菜根結(jié)線蟲(chóng)的種類(lèi)鑒定［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，35（8）：135－138.

［12］伏召輝，仵均祥.楊凌地區(qū)黃瓜根結(jié)線蟲(chóng)種類(lèi)鑒定［J］.陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（5）：30－32.

［13］高赟，漆永紅，劉永剛，等.甘肅河西地區(qū)番茄根結(jié)線蟲(chóng)病病原鑒定［J］.植物保護(hù)，2009，35（3）：127－129.

［14］漆永紅，呂和平，杜蕙，等.武威市黃瓜根結(jié)線蟲(chóng)病病原鑒定［J］.甘肅農(nóng)業(yè)科技，2009（9）：9－11.

［15］劉維志.植物線蟲(chóng)志［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2004：317－396.

［16］Sasser J N.The international Meloidogyne project－its goals and accomplishments［J］.Annual Review Phytopathology，1983，21：271－288.