張?jiān)＞?王金成， 魏亞東

（天津出入境檢驗(yàn)檢疫局，天津 300461）

松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）屬重要的檢疫性有害生物，引起的松材線蟲病是世界上最具危險(xiǎn)性的森林病害［1－2］。該病已在多個(gè)國家發(fā)生和流行，且呈擴(kuò)散蔓延趨勢。我國自1982年首次在南京市發(fā)現(xiàn)松材線蟲病，目前已蔓延擴(kuò)散到廣東、江蘇、浙江、安徽、山東等省，對(duì)我國林業(yè)造成了嚴(yán)重破壞，對(duì)松林的安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。檢疫是防止該病遠(yuǎn)距離傳播最有效的方式，而簡單、快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測技術(shù)是實(shí)施有效檢疫的強(qiáng)力手段，因此針對(duì)松材線蟲的檢測技術(shù)研究具有重要意義。

松材線蟲的檢測方法主要有形態(tài)學(xué)檢測、生化檢測和分子生物學(xué)檢測三大類［3］，形態(tài)學(xué)對(duì)經(jīng)驗(yàn)的要求比較高，而且存在幼蟲鑒定困難等等問題，生化檢測相對(duì)用得較少，松材線蟲的分子檢測技術(shù)主要有特異 性 引 物 PCR 法［4－5］、ITS－PCR－RFLP 法［6］和實(shí)時(shí) 熒 光 定 量 PCR 法［7－9］（quantitative real－time PCR，qPCR）。這些方法具有高效、快速、低污染等優(yōu)點(diǎn)，但是特異性引物PCR法、ITS－PCR－RFLP法需要電泳、染色、成像等多個(gè)步驟，而實(shí)時(shí)熒光定量PCR法所使用的儀器設(shè)備投入大、標(biāo)記探針、試劑成本高，限制了該方法的推廣［10］。

膠體金免疫層析法（gold immunochromagraphy assay）是20世紀(jì)80年代末發(fā)展起來的一種快速的免疫學(xué)測定方法［11］，它是膠體金標(biāo)記技術(shù)和免疫層析技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，基本原理是利用微孔濾膜的滲濾濃縮和毛細(xì)管作用，使抗原抗體發(fā)生反應(yīng)，在檢測線位置，陽性反應(yīng)在試紙條上出現(xiàn)紅色條帶，陰性反應(yīng)不顯色。通過核酸引物兩端修飾相應(yīng)標(biāo)記物（如生物素、熒光素），同時(shí)試紙條上相應(yīng)位置標(biāo)記對(duì)應(yīng)抗體，就可以實(shí)現(xiàn)核酸產(chǎn)物的試紙條檢測。核酸試紙條技術(shù)已經(jīng)在結(jié)核分枝桿菌 甲型H1N1病毒［13－14］、外源 基 因 EPSPS 的 檢 測［15］等 方 面 都 有 了成功應(yīng)用的報(bào)道，本研究在特異性引物PCR方法的基礎(chǔ)上，結(jié)合核酸試紙條檢測技術(shù)，建立一種簡單、快速、準(zhǔn)確、靈敏的可視化松材線蟲分子檢測技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料及試劑

本試驗(yàn)測試了近年來天津出入境檢驗(yàn)檢疫局植物檢疫實(shí)驗(yàn)室截獲的來源于國外的8個(gè)線蟲種群和4個(gè)來自我國江蘇的線蟲種群，并經(jīng)過了形態(tài)及測序驗(yàn)證，其中包括4個(gè)擬松材線蟲種群，3個(gè)傘滑刃線蟲種群，1個(gè)真滑刃屬線蟲種群，4個(gè)松材線蟲種群。同時(shí)測定了2種植物材料和2種真菌材料（表1）。

表1 供試樣本的種類及來源Table 1 Isolates and origins of samples used in this study

主要試劑為 TIANamp Genomic DNA Kit（購自TIANGEN 公 司）；Ex Taq 酶 試 劑、DL2000DNA Marker（購自TaKaRa公司）；通用型核酸擴(kuò)增物快速檢測試紙條（購自杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司）。

試驗(yàn)主要儀器為PCR儀（PTC－200DNA Engine）；電泳儀（Bio－RAD）；紫外凝膠成像系統(tǒng)（Infinity－3026）。

1.2 線蟲基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增

1.2.1 線蟲基因組DNA提取

將適量線蟲放入1.5mL離心管，稍離心，預(yù)冷后加入適量液氮，用研棒研磨至粉末狀，然后依次加入緩沖液GA、蛋白酶K、緩沖液GB，70℃水浴放置10min，加入乙醇振蕩，混合液加入吸附柱CB3后離心，漂洗2次，晾干吸附柱，在吸附膜滴加50μL TE，離心后得到線蟲基因在DNA，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR引物設(shè)計(jì)

根據(jù)截獲的松材線蟲測序所得的ITS DNA序列，并通過NCBI比對(duì)分析，利用引物設(shè)計(jì)軟件Oligo 6.0設(shè)計(jì)一對(duì)針對(duì)松材線蟲的特異性引物及下游引物的競爭引物，片段大小為197bp，上、下游引物的5′端分別修飾有生物素（biotin）和熒光素（FITC），由Invitrogen公司合成。

上 游 引 物：Bx－F3－bio 5′－TCTGCACGTTGTGACAGTC－3′；下 游 引 物：Bx－B3－fit 5′－TCATCCGAACGTCCCTGAC－3′；競 爭 引 物：Bx－B3－comp 5′－GTCAGGGACGTTCGGAACT－3′；相 關(guān) 引 物 序列已申請(qǐng)發(fā)明專利（專利申請(qǐng)?zhí)枺?0120231555.8）。

1.3 松材線蟲基因組DNA引物特異性試驗(yàn)

試驗(yàn)以滅菌超純水作為空白對(duì)照，分別以Bm－Js1、BmJs2、BmSk1、BmSk2、BdSk1、BFSk1、BrSk1、Auk線蟲種群和2種植物、2種真菌樣本作為陰性對(duì)照，以BxUs1、BxUs2、BxJs1、BxJs2等松材線蟲作為陽性對(duì)照，應(yīng)用松材線蟲特異引物對(duì)（Bx－F3－bio、Bx－B3－fit）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系：10×Ex Taq Buffer 2.5μL，dNTP（2.5mmol／L）1μL，上、下游引物（10μmol／L）各0.5μL，模板DNA 1μL，Ex Taq酶（5U／μL）0.25μL，ddH2O 19.25μL，總體積25μL，隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：94℃ 預(yù)變性2min，1個(gè)循環(huán)；94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。取10μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并記錄結(jié)果。

1.4 PCR產(chǎn)物試紙條檢測試驗(yàn)

取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物滴加在試紙條的樣品墊上，同時(shí)滴加2～3滴緩沖液，10min后觀察質(zhì)控線、檢測線，判讀出陰、陽性的結(jié)果。

1.5 PCR擴(kuò)增中競爭引物最適比例的篩選

試驗(yàn)將上、下游引物與競爭引物（Bx－F3－bio：Bx－B3－fit：Bx－B3－comp）的比例分別按 A（0.5∶0.5∶1）、B（0.5∶0.5∶2）、C（0.5∶0.5∶3）、D（0.5∶0.5∶4）、E（0.5∶0.5∶5）分為5組，每組PCR反應(yīng)以滅菌超純水模板作為空白對(duì)照，以松材線蟲基因組DNA為陽性對(duì)照。

PCR反應(yīng)體系：10×Ex Taq Buffer 2.5μL，dNTP（2.5mmol／L）1μL，上、下游引物（10μmol／L）各0.5μL，競爭引物（10μmol／L）分別加1、2、3、4、5μL，模板DNA 1μL，Ex Taq 酶（5U／μL）0.25μL，ddH2O補(bǔ)足至體積25μL，隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件同1.3，擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和試紙條檢測。

1.6 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物兩種檢測方法的靈敏度測試

將松材線蟲陽性對(duì)照PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別用滅菌ddH2O稀釋1、2、10、20、100、200、1000倍，每個(gè)稀釋梯度各取稀釋后產(chǎn)物5μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳及試紙條檢測，分別在凝膠成像系統(tǒng)、試紙條上觀察并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果及分析

2.1 松材線蟲基因組DNA引物特異性試驗(yàn)

分別提取表1中所列松材線蟲基因組DNA，應(yīng)用松材線蟲特異引物對(duì) Bx－F3－bio、Bx－B3－fit進(jìn)行PCR擴(kuò)增、凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1所示，只有第14、15、16和17泳道分別是松材線蟲 BxUs1、Bx－Us2、BxJs1和BxJs2基因組DNA擴(kuò)增出片段大小197bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，同時(shí)，空白對(duì)照、兩種植物、兩種真菌及8種線蟲種群陰性對(duì)照樣本均無擴(kuò)增產(chǎn)物，說明引物對(duì)Bx－F3－bio、Bx－B3－fit具有良好的特異性。

圖1 松材線蟲特異引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Gel electrophoresis of PCR products with specific primers for B.xylophilus

2.2 PCR擴(kuò)增中競爭引物比例的篩選

上、下游引物與競爭引物的比例、擴(kuò)增體系見材料與方法1.5，每組不同比例引物以水為空白對(duì)照、松材線蟲BxUs1為陽性對(duì)照模板進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物分別用電泳及試紙條檢測，從圖2A凝膠電泳結(jié)果可以看出，空白對(duì)照（A－a1、A－b1、A－c1、A－d1和 A－e1）未見擴(kuò)增產(chǎn)物，說明加入競爭引物對(duì)松材線蟲擴(kuò)增特異性沒有影響，但隨著競爭引物所占比例逐漸升高，電泳特異性條帶的亮度逐漸減弱（圖2中A－a2、A－b2、A－c2、A－d2和 A－e2），說明隨著競爭引物濃度上升，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的量逐漸減少；從圖2－B試紙條檢測結(jié)果可以看出，在競爭引物比例等于或低于0.5∶0.5∶3時(shí)，空白對(duì)照會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果（圖2中B－a1、B－b1、B－c1），隨著競爭引物比例達(dá)到或大于0.5∶0.5∶4時(shí)候，空白對(duì)照中假陽性結(jié)果隨即消失（圖2中B－d1、B－e1），同時(shí)對(duì)陽性對(duì)照的條帶清晰度無影響（圖2中B－d2、B－e2），綜合以上分析，確認(rèn)上、下游引物與競爭引物的比例為 D組（0.5∶0.5∶4），在消除試紙條試驗(yàn)假陽性結(jié)果的同時(shí)保證擴(kuò)增產(chǎn)物的量，因此將其作為最適篩選比例，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 不同競爭引物比例的松材線蟲特異引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖和試紙條圖Fig.2 Gel electrophoresis and nucleic acid strip assay of PCR products amplified with different proportions of the competitive primer to the specific primers for B.xylophilus

2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物兩種檢測方法的特異性測試

用材料與方法1.5中D組（上游引物、下游引物、競爭性物比例為0.5∶0.5∶4）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以水為空白對(duì)照、以Zm1、Lb1兩種植物、Ag1、Fg1兩種真菌、BmJs1BmJs2BmSk1BmSk2BdSk1BFSk1、BrSk1、Auk等8種線蟲種群為陰性對(duì)照，以及BxUs1、BxUs2、BxJs1、BxJs2等松材線蟲為陽性對(duì)照，取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行試紙條檢測（圖3），從檢測結(jié)果可以看出，只有松材線蟲陽性對(duì)照擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)特異性紅色條帶，其余空白對(duì)照及其他各陰性對(duì)照在檢測線位置均無條帶出現(xiàn)，顯示了該檢測方法良好的特異性。

圖3 松材線蟲試紙條檢測方法特異性檢測Fig.3 The specificity of nucleic acid strip assay of B.xylophilus

2.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物兩種檢測方法的靈敏度測試

用凝膠電泳檢測時(shí)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10倍時(shí)，用肉眼難以看見清晰的特異性條帶（圖4A），當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋隨著松材線蟲PCR擴(kuò)增產(chǎn)物濃度的降低，特異性條帶的亮度也逐漸下降；而試紙條檢測法中（圖4B），同樣稀釋梯度，同樣上樣量的情況下，當(dāng)松材線蟲PCR擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋1000倍后，僅憑肉眼仍能觀察到清晰的陽性檢測線，因此核酸試紙條檢測的靈敏性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通凝膠電泳檢測法。

圖4 凝膠電泳檢測法和試紙條法檢測靈敏度比較Fig.4 Sensitivity comparison of gel electrophoresis and NADA

3 討論

本研究通過將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）與核酸試紙條檢測方法相結(jié)合，首次建立了一種核酸試紙條可視化檢測松材線蟲的方法，無需凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物所需要的制膠、電泳、成像等步驟，將2h的檢測時(shí)間縮短為10min，大大提高了檢測效率，靈敏度試驗(yàn)結(jié)果表明核酸試紙條法的檢測靈敏度比傳統(tǒng)電泳凝膠成像高50倍以上，同時(shí)該方法檢測完后只產(chǎn)生少量的紙質(zhì)垃圾，處理簡單，對(duì)環(huán)境友好，而凝膠電泳法檢測結(jié)束后，產(chǎn)生染色凝膠及塑料手套，處理困難，后期處理成本也高。

用凝膠電泳法檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，出現(xiàn)引物間二聚體（cross dimers，CDs）對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的檢測不會(huì)發(fā)生影響，但是應(yīng)用核酸試紙條法時(shí)，如果不消除兩側(cè)同時(shí)帶有標(biāo)記物的引物二聚體，就會(huì)不可避免地出現(xiàn)假陽性結(jié)果，對(duì)檢測結(jié)果產(chǎn)生影響［16－17］，而特異引物的區(qū)段是特定的序列，通過改變引物本身消除引物二聚體存在一定的局限性，本研究在PCR反應(yīng)體系中加入一定比例的競爭引物（competitive oligonucleotide primer，COP），用于防止帶標(biāo)記的上、下游引物間形成引物二聚體，從而消除帶標(biāo)記引物二聚體的形成，可以很好地消除假陽性對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。

本研究中應(yīng)用的可視化試紙條檢測方法與松材線蟲已有的普通PCR電泳法、ITS－PCR－RFLP法和實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)相比，儀器、成本大大降低，檢測時(shí)間上耗時(shí)更短，提高了出入境口岸松材線蟲的鑒定工作效率，能更好地適應(yīng)進(jìn)出口貿(mào)易快速通關(guān)的要求，所使用的PCR產(chǎn)物檢測試紙條是個(gè)通用型試紙條，可以廣泛應(yīng)用于PCR診斷試劑的開發(fā)，該檢測方法無需電泳儀、凝膠成像儀等儀器設(shè)備投入，應(yīng)用成本低，對(duì)于PCR檢測方法在基層實(shí)驗(yàn)室的推廣應(yīng)用將有著巨大的推動(dòng)作用。

可視化快速核酸試紙條法具有操作便利、特異性強(qiáng)、靈敏度高，結(jié)果直觀、穩(wěn)定、可靠、對(duì)環(huán)境友好等多項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)，適合口岸檢疫實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行松材線蟲的快速篩查。

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