相 棟， 梁巧蘭， 徐秉良， 劉雪峰

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室，中－美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，蘭州 730070）

三葉草又名車軸草，廣泛應(yīng)用于城市美化、水土保持、綠肥壓青、飼用牧草和醫(yī)藥等領(lǐng)域［1－3］。適宜生長在溫暖濕潤的環(huán)境中，為各種病蟲害的滋生提供了機(jī)會(huì)，病毒病作為三葉草主要病害之一，在世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生［4］。已報(bào)道可以感染三葉草的病毒至少有十余種，其中，以苜?；ㄈ~病毒（AWV）和白三葉草花葉病毒（WCMV）危害較嚴(yán)重［5－7］。三葉草感染病毒后，常表現(xiàn)為葉片壞死，系統(tǒng)花葉畸形等癥狀，嚴(yán)重影響其品質(zhì)和價(jià)值。國內(nèi)外至今還沒有找到防治包括三葉草病毒病在內(nèi)的植物病毒病切實(shí)有效的方法。因此，加強(qiáng)檢測檢疫工作，了解病情的分布動(dòng)態(tài)，從而有針對(duì)性地采取無毒種苗、隔離檢疫、銷毀病株等措施，是防控該類病害的重要措施之一。

近年來，隨著三葉草在我國綠肥作物以及園林設(shè)計(jì)中的應(yīng)用不斷增多，三葉草在甘肅省種植面積也逐年擴(kuò)大，然而，病毒病的發(fā)生也日益加重，嚴(yán)重影響其長勢和品質(zhì)，使其經(jīng)濟(jì)價(jià)值得不到充分發(fā)揮，已成為影響三葉草栽培和持續(xù)利用的主要限制因素之一。為此對(duì)甘肅省蘭州市綠化帶及種植區(qū)三葉草病毒病的發(fā)生情況進(jìn)行了詳細(xì)的調(diào)查，對(duì)其主要病毒病原進(jìn)行了鑒定，并測定了其寄主范圍，試驗(yàn)結(jié)果對(duì)指導(dǎo)甘肅省三葉草的種植，減輕病毒病的發(fā)生具有重要意義?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 病害調(diào)查和毒源采集

2010－2012年間，于每年4－9月中、下旬對(duì)蘭州市不同區(qū)綠化帶（南北濱河路綠化帶、五泉山綠化區(qū)、西湖公園綠化區(qū)、南昌路綠化帶等）、甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)校園、甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)紅三葉草試驗(yàn)田、蘭州市榆中縣紅三葉草試驗(yàn)田三葉草病毒病的發(fā)生定期定點(diǎn)進(jìn)行調(diào)查，其中，除了甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)紅三葉草試驗(yàn)田、蘭州市榆中縣紅三葉草試驗(yàn)田以紅三葉草為調(diào)查和采集對(duì)象，其余地塊均為白三葉草。所有調(diào)查采用五點(diǎn)取樣法，每樣點(diǎn)取1m2，調(diào)查其中50株的150片葉，共750片葉，按以下9級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況，計(jì)算發(fā)病率及病情指數(shù)。

三葉草病毒病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［8］為，0級(jí)：無癥狀；1級(jí)：輕度花葉；3級(jí)：中度花葉；5級(jí)：輕微皺縮或輕花葉皺縮；7級(jí)：花葉或皺縮或畸形；9級(jí)：重度花葉且皺縮或壞死。

按以下公式計(jì)算發(fā)病率和病情指數(shù)：

調(diào)查過程中用無菌塑料袋采集具病毒病典型癥狀的白三葉草和紅三葉草葉片為試材，樣品一式3份，一份于4℃冰箱短期保存、一份于－20℃冰箱保存，另一份長期保存于－70℃冰箱中，部分樣品將病株整體移回，種植于實(shí)驗(yàn)室隔蟲網(wǎng)室中，進(jìn)一步觀察研究。

1.2 環(huán)境因素對(duì)白三葉草病毒病發(fā)生的影響

以白三葉草（Trifolium repens Linn.）作為供試植物，將消毒三葉草種子播種在滅菌的土壤中，置于防蟲網(wǎng)室中培養(yǎng)。等株高達(dá)到13cm左右時(shí)，將采集的白三葉草病葉用pH7.0磷酸緩沖液按1∶2（m／V）冰浴勻漿后摩擦接種［9］于供試植株上，分別置于相對(duì)濕度為45%，溫度5、10、15、20、25、30℃下和溫度為25℃，相對(duì)濕度為30%、45%、60%、75%、90%下觀察其發(fā)病狀況并統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)［10］。每種供試植物接種5株，以接種磷酸緩沖液為對(duì)照，重復(fù)3次。溫度、濕度通過RXZ型智能人工氣候箱控制。

1.3 三葉草病毒病病原鑒定及寄主范圍測定

1.3.1 三葉草病毒病病原鑒定

采用雙抗體夾心法（double antibody sandwich ELISA DAS－ELISA），按武漢基因美公司提供的AMV、WCMV DAS－ELISA試劑盒試驗(yàn)步驟進(jìn)行測定。田間采集的正常植株葉片及具有典型病毒病癥狀的三葉草葉片為試驗(yàn)材料，分別記為，W0：正常；W1：黃斑花葉；W2：斑駁花葉；W3：花斑花葉；W4：叢簇矮化；W5：皺縮褪綠；W6：環(huán)斑及環(huán)紋每個(gè)樣品設(shè)4個(gè)重復(fù)。

最后結(jié)果首先通過目測法觀察，即如果陽性對(duì)照變色，空白、陰性對(duì)照都沒有變色，觀察待測材料是否發(fā)生顏色變化；然后進(jìn)一步進(jìn)行酶標(biāo)儀測定法，即用550型酶聯(lián)免疫測定儀（Bio－Rad廠家產(chǎn)品），分別測定450nm下各孔的A值，并根據(jù)公式：臨界值（CUT OFF）＝陰性對(duì)照A 平均值＋0.15，當(dāng)樣品A值≥臨界值者，為陽性（＋）帶毒；當(dāng)樣品A值＜臨界值者，為陰性（－）不帶毒。

1.3.2 三葉草病毒病病原提純

根據(jù)金磊磊［11］報(bào)道的苜?；ㄈ~病毒提純方法和Wetter［12］報(bào)道的白三葉草花葉病毒提純方法，分別對(duì)AMV、WCMV進(jìn)行提純，然后將提純的病毒分別接種于心葉煙、菜豆上進(jìn)一步擴(kuò)繁保存。

1.3.3 寄主范圍測定

以種植于隔蟲網(wǎng)室中的昆諾藜、莧色藜、心葉煙、普通煙、本氏煙、番茄、辣椒、龍葵、菜豆、豇豆、苜蓿、地三葉、豌豆、藿香薊、鵝絨藤、萵苣、向日葵、黃瓜、千日紅、雞冠花、大白菜等7科21種植物作為供試寄主，將提純擴(kuò)繁的AWV、WCMV采用汁液摩擦分別接種（方法同1.2）于以上2～3葉期供試寄主幼苗，以接種磷酸緩沖液為對(duì)照，每種植物接種6～10株，重復(fù)2次，置于防蟲網(wǎng)室中觀察記錄癥狀表現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 三葉草病毒病田間發(fā)病情況

2.1.1 田間發(fā)生情況

通過2010－2012年連續(xù)3年對(duì)蘭州市三葉草病毒病調(diào)查發(fā)現(xiàn)，4－9月三葉草病毒病均有發(fā)生，平均發(fā)病率為28.14%，平均病情指數(shù)為17.45；田間癥狀主要為花葉、褪綠皺縮、斑駁、叢簇矮化。調(diào)查還發(fā)現(xiàn)，紅三葉草平均發(fā)病率和平均病情指數(shù)均高于白三葉草，不同地區(qū)發(fā)病情況不同。由于三葉草為多年生植物，發(fā)病情況嚴(yán)重的地塊每年都保持較為嚴(yán)重的發(fā)病率。

表1 甘肅省蘭州市三葉草病毒病發(fā)病情況Table 1 Prevalence of clover virus disease in Lanzhou City，Gansu Province

2.1.2 田間癥狀類型

調(diào)查結(jié)果表明，三葉草受到病毒侵染后，在田間的癥狀類型主要有以下幾種（圖1）：

（1）黃斑花葉：沿葉脈產(chǎn)生褪綠條點(diǎn)，連接為褪綠黃條斑，形成黃色條紋或不規(guī)則花葉（癥狀代號(hào)為YM）；

（2）斑駁花葉：葉片上出現(xiàn)黃綠相間的斑駁花葉，或葉脈壞死、葉片皺縮，后逐漸形成壞死斑（癥狀代號(hào)為MoM）；

（3）花斑花葉：葉片呈現(xiàn)弱的、散射的、有時(shí)是不規(guī)則的淡黃色或白色花斑（癥狀代號(hào)為VaM）；

（4）叢簇矮化：頂部葉片扭曲不能正常張開，有的葉片沿葉脈皺縮壞死，植株嚴(yán)重矮化（癥狀代號(hào)為Rstu）；

（5）皺縮褪綠：葉片扭曲皺縮，并在皺縮處出現(xiàn)不規(guī)則褪綠或由邊緣開始向內(nèi)褪綠（癥狀代號(hào)為Shch）；

（6）環(huán)斑及環(huán)紋：一般出現(xiàn)于田間垂直下部葉片，整個(gè)葉片出現(xiàn)圓形或近圓形斑，有4～50個(gè)不等，后期逐漸連接造成壞死斑（癥狀代號(hào)為RS＆RP）；

（7）其他癥狀類型：沿葉片主脈，整個(gè)葉片由中間向兩邊褐化；葉片邊緣或整個(gè)葉片沿著葉脈紅葉；葉片出現(xiàn)褐色短線。

其中，（1）、（5）、（6）、（7）癥狀表現(xiàn)在白三葉草上；（2）、（3）、（4）癥狀表現(xiàn)在紅三葉草上。

2.1.3 三葉草病毒病田間發(fā)生流行動(dòng)態(tài)

通過三葉草病毒病田間發(fā)生流行動(dòng)態(tài)研究表明，在不同季節(jié)三葉草病毒病發(fā)生情況不同（圖2），白三葉草和紅三葉草發(fā)病癥狀及高峰期有明顯差別。5月均表現(xiàn)出不同程度的病毒病癥狀，4月下旬到5月上旬白三葉草達(dá)到發(fā)病高峰，發(fā)病率和病情指數(shù)分別為29.62%、14.04，6月紅三葉草達(dá)到發(fā)病高峰，發(fā)病率和病情指數(shù)分別為56.53%、34.34。在發(fā)病高峰期，白三葉主要癥狀表現(xiàn)為黃斑花葉，紅三葉主要癥狀表現(xiàn)為花斑花葉、叢簇矮化。

圖1 三葉草病毒病田間癥狀類型Fig.1 Symptom types of clover virus disease in the field

圖2 不同時(shí)期三葉草病毒病發(fā)生情況Fig.2 Occurrence status of clover virus disease during difference periods

2.2 環(huán)境因素對(duì)三葉草病毒病發(fā)生的影響

2.2.1 溫度對(duì)三葉草病毒病發(fā)生的影響

通過溫度對(duì)三葉草病毒病發(fā)生的測定表明，溫度在5～30℃三葉草病毒病均能發(fā)生。當(dāng)溫度為25℃時(shí)，發(fā)病最重，病情指數(shù)為74.81；當(dāng)溫度為30℃時(shí)發(fā)病最輕，病情指數(shù)為40.00。方差分析表明，當(dāng)溫度為15、20、25℃時(shí)，3個(gè)處理之間無顯著性差異，但是與其他處理5、10、30℃間存在顯著性差異（圖3）。

圖3 溫度與三葉草病毒病發(fā)生的關(guān)系Fig.3 The relationships between different temperatures and occurrence of clover virus disease

2.2.2 濕度對(duì)三葉草病毒病發(fā)生的影響

不同相對(duì)濕度條件下三葉草病毒病均能發(fā)生。隨著相對(duì)濕度的增大，病情指數(shù)先升高后降低。當(dāng)相對(duì)濕度45%時(shí)，病害發(fā)生最嚴(yán)重，病情指數(shù)達(dá)到最大為74.07；而相對(duì)濕度為60%時(shí)，病情指數(shù)最低，為30.37，其他3個(gè)處理發(fā)病情況介于兩者之間。方差分析表明，相對(duì)濕度為45%時(shí)比其他處理發(fā)病顯著嚴(yán)重，其他處理之間無顯著性差異（圖4）。

圖4 相對(duì)濕度與三葉草病毒病發(fā)生的關(guān)系Fig.4 The relationships between different humidity conditions and occurrence of clover virus disease

2.3 三葉草病毒病生物學(xué)測定

2.3.1 三葉草病毒病病原DAS－ELISA檢測

DAS－ELISA對(duì)28份三葉草樣品AMV、WCMV的檢測結(jié)果表明：具有典型癥狀的6類樣品均受到AMV的侵染（表2），目測發(fā)現(xiàn)其均有不同程度的黃色顯示，酶標(biāo)儀檢測結(jié)果均為陽性帶毒，AMV的檢出率為100%；皺縮褪綠型目測觀察發(fā)現(xiàn)其輕微顯色，但酶標(biāo)儀檢測結(jié)果顯示A值小于臨界值為陰性外，其余5類均受到WCMV的侵染（表2），其目測觀察與酶標(biāo)儀檢測結(jié)果相一致，WCMV的檢出率為83.3%；正常葉片兩種病毒均未檢測出。通過ELISA檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)在6類三葉草樣品中存在AMV和WCMV復(fù)合侵染的現(xiàn)象，復(fù)合侵染率為83.3%。

2.3.2 AMV寄主范圍測定

通過AMV寄主范圍測定表明，用PB緩沖液（pH7.0）作對(duì)照，通過重復(fù)處理發(fā)現(xiàn)，AMV可以侵染6科16種植物，不同寄主潛育期不同，接種3d后表現(xiàn)癥狀不等，主要癥狀有系統(tǒng)花葉、褪綠、枯斑等。在不同寄主上的癥狀反應(yīng)如表3所示。

表2 三葉草病毒病原DAS－ELISA檢測結(jié)果Table 2 Detection of the clover viral pathogens by DAS－ELISA

表3 AMV在不同測試寄主上的反應(yīng)1）Table 3 The reaction of AMV against different test hosts

續(xù)表3 Table 3（Continued）

2.3.3 WCMV寄主范圍測定

WCMV寄主范圍測定表明，WCMV可侵染豌豆、菜豆、豇豆、苜蓿、昆諾藜，癥狀反應(yīng)如表4所示，在其他植物上未表現(xiàn)出侵染癥狀。

表4 WCMV在不同測試寄主上的反應(yīng)Table 4 The reaction of WCMV against different test hosts

3 結(jié)論與討論

對(duì)蘭州市不同綠化帶及試驗(yàn)種植區(qū)三葉草病毒病癥狀表現(xiàn)和發(fā)病情況調(diào)查表明，三葉草病毒病在調(diào)查區(qū)普遍發(fā)生，平均發(fā)病率為28.14%，病情指數(shù)為17.45。三葉草病毒病癥狀類型主要有6種，其中，花葉型和皺縮型比較普遍，并且在紅三葉草和白三葉草上的癥狀類型不同。病原主要以侵染葉片對(duì)三葉草生長造成危害。4月下旬到5月上旬白三葉草達(dá)到發(fā)病高峰，主要癥狀為黃斑花葉；6月份紅三葉草達(dá)到發(fā)病高峰，主要癥狀為花斑花葉、叢簇矮化。8月份蘭州市溫濕度相對(duì)較高，此時(shí)黃斑花葉型癥狀基本消失，9月下旬到10月份黃斑花葉和花斑花葉兩種癥狀的發(fā)生又達(dá)到一個(gè)高峰期。三葉草病毒病的發(fā)生與溫、濕度均有很大的關(guān)系，當(dāng)溫度為25℃、相對(duì)濕度為45%時(shí)接種白三葉草幼苗發(fā)病較重，這與調(diào)查一致。當(dāng)溫度過高時(shí)有些癥狀消失，這可能與存在隱癥現(xiàn)象有關(guān)。

引起甘肅省蘭州市三葉草病毒病的主要病原為苜蓿花葉病毒（AMV）和白三葉草花葉病毒（WCMV），通過DAS－ELISA檢測法其檢出率分別為100%、83.3%，田間自然感病三葉草以復(fù)合侵染為主，復(fù)合侵染率為83.3%。McLaughlin［13］在對(duì)美國東南部豆科牧草病毒病檢測中，通過ELISA檢測在白三葉草和紅三葉草上AWV、WCMV的檢出率分別為9.4%、7.3%。據(jù)報(bào)道三葉草黃葉脈病毒（Clover yellow vein virus，CYVV）、紅三葉草脈花葉病毒（Red clover vein mosaic virus，RCVMV）、大豆矮縮病毒（Soybean dwarf virus，SbDV）、菜豆黃花葉病毒（Bean yellow mosaic virus，BYMV）也是侵染三葉草的主要病原［5－7，14］，田間自然感病三葉草是否還受CYVV、RCVMV、SbDV、BYMV感染還有待進(jìn)一步檢測，并且近年來與RT－PCR和核酸分子雜交相結(jié)合的方法可使檢測更為準(zhǔn)確［15］。

寄主范圍測定表明，經(jīng)提純的AMV分離物在豇豆、菜豆、豌豆、苜蓿、黃瓜、昆諾藜、莧色藜、番茄、辣椒、心葉煙、普通煙、大白菜、雞冠花等一些測試寄主上的反應(yīng)與國內(nèi)魏寧生［16］及陳集雙等［17］報(bào)道的苜?；ㄈ~病毒分離物Wc及SHy在測試寄主上的癥狀反應(yīng)相似，但在千日紅不表現(xiàn)系統(tǒng)黃斑與報(bào)道存在差異，并發(fā)現(xiàn)向日葵也為寄主；WCMV在國內(nèi)尚未報(bào)道，這可能與我國環(huán)境、栽培制度以及它經(jīng)常和其他病毒復(fù)合侵染有關(guān)系，但本試驗(yàn)提純的WCMV在豌豆、菜豆、昆諾藜等上的癥狀與Jacqueline［18］、Potter［19］及 Gardiner［20］報(bào)道的相似。

本試驗(yàn)僅對(duì)蘭州市三葉草病毒病的發(fā)生與溫度、濕度的關(guān)系進(jìn)行了初步探討，對(duì)于不同品種、氣象因素、傳毒昆蟲遷飛動(dòng)態(tài)等與病毒病發(fā)生的關(guān)系尚未涉及；并且測試寄主植物也僅限于試驗(yàn)中選取的種類，是否還有其他寄主，有關(guān)這些問題還有待進(jìn)一步研究。

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