張 良 韓 丹 趙詩萌 吳紅敏 (中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院新生兒科，遼寧 沈陽 110001)

廣譜抗腫瘤藥物環(huán)磷酞胺(CTX)屬潛伏氮芥類烷化劑，可誘導(dǎo)產(chǎn)生染色體變異，導(dǎo)致細(xì)胞周期、形態(tài)、生理等方面發(fā)生改變，但其缺乏特異性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時，也破壞機體的正常細(xì)胞。腫瘤抑素30肽(T30)是含有多個精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列的抗腫瘤多肽〔1〕，具有專一作用于腫瘤細(xì)胞的功能，對正常細(xì)胞沒有殺傷;可以促進多種腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤生長，與化療藥物CTX聯(lián)合應(yīng)用具有明顯的抗腫瘤疊加作用。至今RGD多肽對于CTX導(dǎo)致的正常細(xì)胞損傷的影響沒有報道。本研究觀察T30肽對CTX誘導(dǎo)的HL7702凋亡是否具有抑制作用，為靶標(biāo)的抵抗化療損傷藥物研究提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料 HL7702由日本醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究中心提供。水溶性四氮唑(WST-1)凋亡檢測試劑盒購自碧云天，錨定蛋白-異氰硫酸熒光素-碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)凋亡檢測試劑盒購自凱基生物科技;EB、AO購自羅氏。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 在含10%滅活新生牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液中，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代1次。

1.2.2 繪制細(xì)胞生長曲線 將對數(shù)生長期的HL7702細(xì)胞用0.25%胰酶消化，含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液吹打成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104/ml，每孔100 μl分別加入到4塊96孔培養(yǎng)板中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24 h細(xì)胞貼壁后，向各孔中分別加入 CTX(濃度為4 μg/ml)、CTX+RGD-T30(濃 度 依 次 為 20、40、60、80、100 μg/ml，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔)。分別培養(yǎng)24 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次后，各孔加入100 μl無血清培養(yǎng)基和10 μl WST-1，繼續(xù)在37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h。酶標(biāo)儀測定各孔光密度(OD值)，空白孔調(diào)零，選擇450 nm為測定波長，630 nm為參考波長，以藥物濃度為橫坐標(biāo)，OD為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。實驗重復(fù)三次，確定結(jié)果穩(wěn)定性。

1.2.3 AO/EB雙染色實驗 24孔板按5×104個細(xì)胞/孔密度接種細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h后向各孔中分別加入CTX(濃度為4 μg/ml)，CTX+RGD-T 30(濃度依次為 20、40、60 μg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗2遍，每孔分別加200 μl AO染液(100 μg/ml)及 200 μl EB 染液(100 mg/L)，室溫放置5 min，在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 Annexin-V-FITC/PI流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞處理方法同上，PBS清洗細(xì)胞2次，0.25%胰酶消化細(xì)胞，500 g離心5 min收集細(xì)胞。收集1×106單細(xì)胞懸液.，加入Binding buffer 100 μl 和 Annexin-V-FITC(20 μg/ml)10 μl，室溫避光30 min。加入 PI(50 μg/ml)5 μl，用 Binding buffer加至 400 μl，用碘化丙錠染色流式細(xì)胞術(shù)(FACS)進行定量檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用獨立樣本的t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 RGD-30T對CTX誘導(dǎo)的HL7702生長抑制的影響 在單獨存在CTX時，HL7702均處于生長抑制狀態(tài)，當(dāng)加入 RGDT30肽時，實驗組細(xì)胞生長抑制明顯改善，并隨著RGD多肽濃度的增加，450 nm波長處的吸光值呈上升趨勢，呈現(xiàn)出濃度依賴性，即細(xì)胞生長速度增加，T30 肽濃度為 20、40、60、80、100 μg/ml時 OD 值分別為 0.184 ± 0.03、0.192 ± 0.041、0.372±0.091、0.579±0.175、0.613±0.216。當(dāng) T30肽濃度達到40 μg/ml時，促進生長作用顯著增加，各組與陰性對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義。T30肽濃度在20～40 μg/ml時，這種保護作用呈平臺期特征。結(jié)果顯示，T30肽對CTX誘導(dǎo)的HL7702生長抑制具有拮抗作用。

2.2 RGD-30T對CTX誘導(dǎo)的HL7702細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響單獨應(yīng)用CTX組，絕大部分細(xì)胞核被染成橙紅色，核皺縮或碎裂，為晚期凋亡或死亡細(xì)胞。T30肽與CTX聯(lián)合應(yīng)用時，T30肽強烈抑制了CTX對HL7702的損傷作用，凋亡細(xì)胞明顯減少，絕大多數(shù)細(xì)胞形態(tài)飽滿，幾乎沒有死亡細(xì)胞。AO/EB染色實驗結(jié)果表明，從形態(tài)角度觀察，RGD-T30對 CTX誘導(dǎo)的HL7702細(xì)胞凋亡形態(tài)具有抑制作用。見圖1。

圖1 不同濃度T30肽與HL-7702細(xì)胞的保護作用

2.3 RGD-30T對CTX誘導(dǎo)的HL7702細(xì)胞凋亡的影響 Annexin-V-FITC/PI染色，CTX單獨處理的HL7702細(xì)胞組24 h晚期凋亡細(xì)胞占30.2%，CTX與T30共處理細(xì)胞組凋亡細(xì)胞分別占19.2%和13.1%、7.1%?？梢姡S著T30肽濃度增加，凋亡細(xì)胞逐漸減少，活細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞明顯增多。CTX單獨處理的HL7702細(xì)胞組24 h早期凋亡細(xì)胞占57.2%，CTX與T30共處理細(xì)胞組凋亡細(xì)胞分別占29.7%和17.1%、9.5%?？梢?，隨著T30肽濃度增加，早期凋亡細(xì)胞逐漸減少，活細(xì)胞明顯增多。

3 討論

惡性腫瘤的治療手段有多種，化療仍是目前極為重要的基本手段之一〔2〕，但其靶向性差。多數(shù)抗腫瘤藥物均可在殺死腫瘤細(xì)胞的同時無選擇地破壞正常組織，廣泛而嚴(yán)重的急性和慢性化療損傷，限制了在癌癥治療中的作用〔3〕。因此在抗腫瘤治療時，能達到最大殺傷腫瘤細(xì)胞并對正常組織產(chǎn)生最小破壞作用的臨床目的已經(jīng)成為化療藥物臨床應(yīng)用目標(biāo)。這方面的研究也是當(dāng)今抗腫瘤藥物研究與開發(fā)領(lǐng)域的一大熱點〔4〕。

Arap等〔5〕獲得了能特異性和腫瘤新生血管結(jié)合的小肽RGD，將其與具有抗血管形成作用的常規(guī)化療藥物阿霉素交聯(lián)，發(fā)現(xiàn)導(dǎo)向性的阿霉素可以使人乳腺癌移植瘤小鼠存活時間明顯延長，且毒副反應(yīng)降低。目前研究發(fā)現(xiàn)，含有RGD序列的蛋白或肽，與整合素結(jié)合，參與細(xì)胞的分化、增殖、凋亡、黏附、形態(tài)發(fā)生等生物學(xué)過程，在組織器官發(fā)生、創(chuàng)傷修復(fù)及腫瘤的發(fā)生、浸潤轉(zhuǎn)移等生理和病理過程中發(fā)揮重要作用〔6〕。腫瘤抑素27肽與RGD活性三肽〔7〕結(jié)合后形成T30肽，具有更強的抑制血管新生抗腫瘤作用〔8〕，在與CTX的實驗中發(fā)現(xiàn)，T30肽與CTX協(xié)同抗腫瘤時，不僅可以增強CTX的抗腫瘤作用，同時，可能有效的抑制CTX對正常細(xì)胞帶來的損傷作用。通過HL7702細(xì)胞進一步證實這一現(xiàn)象。本實驗結(jié)果表明，含RGD的抗腫瘤活性肽T30肽在濃度達到40 μg/ml時，不僅可以增加CTX對腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤作用，同時又能抵抗因使用 CTX對HL7702正常肝細(xì)胞損傷的保護作用。為今后相對降低CTX用藥劑量，降低治療成本，同時又能夠降低用CTX帶來的毒副作用，顯示出良好的應(yīng)用前景。

CTX是臨床應(yīng)用最普遍的光譜抗腫瘤化療藥物之一，T30肽在近年來也有大量文獻報道其抗腫瘤作用，但未見其與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用促進腫瘤細(xì)胞凋亡的同時對正常細(xì)胞的保護作用。為探求RGD-T30對于CTX損傷HL7702細(xì)胞保護作用的研究中，考慮到WST-1細(xì)胞增殖試驗，這是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法。WST-1是一種類似于噻唑藍(MTT)的化合物，是MTT的一種升級替代產(chǎn)品，和MTT或其它MTT類似產(chǎn)品如XTT、MTS等相比有明顯的優(yōu)點。首先WST-1和XTT、MTS產(chǎn)生的formazan都是水溶性的，可以省去后續(xù)的溶解步驟。其次，WST-1性質(zhì)比XTT和MTS更加穩(wěn)定，使實驗結(jié)果更加穩(wěn)定。另外，WST-1和MTT、XTT等相比，線性范圍更寬，靈敏度更高。故實驗結(jié)果更加精確可信。

在本研究發(fā)現(xiàn)在HL7702細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入CTX肽和不同的T30肽(0～100 μg/ml)培養(yǎng)24 h，細(xì)胞的增殖抑制在T30肽濃度達到20 μg/ml后得到改善，T30肽濃度達到40 μg/ml后具有明顯的劑量依賴性，同樣AO/EB雙染實驗和Annexin-V-FITC/PI流式細(xì)胞實驗也支持這一實驗結(jié)果。

在本研究中，首次發(fā)現(xiàn)含RGD序列的抗腫瘤多肽具有對CTX引起的正常細(xì)胞損傷的保護作用，但本結(jié)果僅提示含RGD抗腫瘤多肽全長具有此保護作用，因工作沒有涉及不含RGD的多肽對CTX引起的正常細(xì)胞損傷是否同樣具有此保護作用，所以還不能明確此保護作用完全來自于RGD序列。這也是進一步工作的研究方向。

1 Carini F，Saggese V，Porcaro G，et al.Surgical protocol in patients at risk for bisphosphonate osteonecrosis of the jaws:clinical use of serum telopetide CTX in preventive monitoring of surgical risk〔J〕.Ann Stomatol(Roma)，2012;3(1):31-6.

2 Wu M，Kelley MR，Kent Hansen W，et al.Reduction of BCNU toxicity to lung cells by high-level expression of O6-methylguanine-DNA methyltransferase〔J〕.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2001;280(4):755-61.

3 Ragg S，Xu-Welliver M，Bailey J，et al.Direct reversal of DNA damage by mutant methyltransferase protein protects mice against dose-intensified chemotherapy and leads to in vivo selection of hematopoietic stem cells〔J〕.Cancer Res，2000;60(18):5187-95.

4 馬培奇.細(xì)胞保護劑氨磷汀及其臨床應(yīng)用及展望〔J〕.中國腫瘤，2001;10(8):471-2.

5 Arap W，Pasqulini R，Ruoslahti E.Cancer treatment by targeted drug delivery to tumo vasculature in a mouse model〔J〕.Science，1988;279(5349):377-80.

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7 Wu ZZ，Li P，Huang QP，et al.Inhibition of adhesion of hepatocellular carcinoma cells to basement membrane components by receptor competition with RGD-or YIGSR-containing synthetic peptides〔J〕.Biorheology，2003;40(4):489-502.

8 Stollman TH，Ruers TJ，Oyen WJ，et al.New targeted probes for radioimaging of angiogenesis〔J〕.Methods，2009;48(2):188-92.