鄒金發(fā) 齊鳳杰 董新茜 劉曉光 (遼寧醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，遼寧 沈陽(yáng) 121000)

高脂血癥(HLP)是胰島素抵抗(IR)、肥胖癥、糖尿病、心腦血管病等疾病主要的危險(xiǎn)因素〔1〕。脂肪組織不僅是體內(nèi)主要的能量?jī)?chǔ)存器官，而且是重要的內(nèi)分泌器官，分泌多種細(xì)胞因子和炎癥因子，如瘦素、脂聯(lián)素(APN)、抵抗素以及腫瘤壞死因子－α(TNF－α)、白細(xì)胞介素－6(IL－6)等，其中 TNF－α 和 IL6 也是重要的免疫調(diào)節(jié)因子。這些因子均可以影響機(jī)體的代謝狀態(tài)，從而影響IR的發(fā)生發(fā)展，而IR與肥胖、2型糖尿病、脂質(zhì)代謝異常、心血管疾病的發(fā)生有密切的關(guān)系。原花青素(procyanidin)是一大類(lèi)多酚類(lèi)化合物的總稱(chēng)，具有廣泛的藥理活性，主要表現(xiàn)為抗氧化清除自由基、保護(hù)心血管和抗高血壓、抗腫瘤、抗炎癥〔2〕等作用。有研究報(bào)道，原花青素具有改善 IR的作用〔3〕。本課題擬探討原花青素對(duì)HLP所致肥胖及IR作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑材料及儀器 甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL－C)、低密度脂蛋白(LDL－C)試劑盒購(gòu)自南京建成生物制品研究所。大鼠血清胰島素、瘦素、APN、抵抗素、TNF－α、IL－6放免試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物制品公司。SD雄性大鼠，SPF級(jí)，體重(250±10)g，由醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。全自動(dòng)生化分析儀。

1.2 大鼠HLP模型的建立 40只SD雄性大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組(C)、HLP模型組(H)、原花青素高劑量組(HD)、原花青素低劑量組(LD)，每組10只。常規(guī)飼養(yǎng)1 w后，除對(duì)照組給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)外，其余三組給予高脂飼料(基礎(chǔ)飼料87.8%，豬油15%，膽固醇2%，膽酸鈉0.2%)。動(dòng)物室溫度為20℃ ～23℃，相對(duì)濕度為40% ～60%，動(dòng)物置正負(fù)壓獨(dú)立通風(fēng)籠具(IVC)喂養(yǎng)，自由飲水與進(jìn)食，每周稱(chēng)量體重并記錄進(jìn)食量。實(shí)驗(yàn)期為6 w。

1.3 給藥方法 大鼠造模的同時(shí)，各組分別給予相應(yīng)藥物灌胃。根據(jù)預(yù)試結(jié)果確定原花青素高、低劑量組的給藥劑量為200、100 mg·kg－1·b－1，對(duì)照組給予相應(yīng)體積的生理鹽水，連續(xù)6 w。

1.4 標(biāo)本處理 大鼠灌藥6 w后，禁食12 h，用10%水合氯醛0.1 ml/100 g麻醉，從腹主動(dòng)脈取血，裝入抗凝和不抗凝試管中，將不抗凝試管在4℃下3 000 r/min離心10 min，分離血清，待測(cè)相應(yīng)指標(biāo)。

1.5 指標(biāo)的測(cè)定 采用酶法測(cè)定血清 TC、TG、LDL－C和HDL－C水平。血清胰島素、瘦素、APN、抵抗素以及 TNF－α、IL－6水平測(cè)定按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK法。

2 結(jié)果

2.1 原花青素對(duì)HLP大鼠體重的影響 實(shí)驗(yàn)期間(灌胃6 w)，大鼠的平均體重增長(zhǎng)。1～4 w體重?zé)o明顯變化，6 w后HLP各組大鼠的體重較對(duì)照組明顯增加(P＜0.01)，而在使用高劑量的原花青素后，大鼠體重較H組減輕(P＜0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)間體重變化(±s，g，n=10)

表1 各組大鼠不同時(shí)間體重變化(±s，g，n=10)

與C組比較:1)P＜0.01;與H組比較:2)P＜0.01

組別1 w 2 w 4 w 6 w C組 247.17±7.96 248.67±6.54 249.67±5.71 251.56 0.000 0.000 0.000 0.002±4.12 H組 250.72±9.95 253.32±6.93 255.42±6.34 257.86±2.671)LD組 245.53±4.09 246.03±3.37 249.43±4.11 254.63±4.27 HD組 244.80±9.07 244.90±6.87 246.90±6.87 253.63±2.312)F值 29.128 45.222 17.461 5.782 P值

2.2 原花青素對(duì)HLP大鼠血脂的影響 原花青素干預(yù)6 w后H組大鼠的血清TC、TG、LDL－C均較C組增高(P＜0.01或P＜0.05)，而HDL－C較對(duì)照組降低(P＜0.01);原花青素低劑量組、高劑量組 TG、TC、LDL－C水平較 H癥組顯著降低(P＜0.01);而低、高劑量組 HDL－C水平較 H組顯著增高(P＜0.01)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血脂含量(±s，mmol/L，n=10)

表2 各組大鼠血脂含量(±s，mmol/L，n=10)

與C組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與H組比較:3)P＜0.01

組別0.000 0.000 0.000 0.000 3.48±0.44 0.85±0.45 3.03±0.86 0.51±0.63 H組 4.05±0.132) 2.05±0.492) 2.73±0.212) 0.59±0.241)LD組 3.50±0.943)1.51±0.522)3)3.35±0.102)3)0.52±0.313)HD組 3.42±0.103)1.35±0.522)3)3.32±0.192)3)0.49±0.183)F值 93.448 704.52 34.164 12.206 P值TC TG HDL－C LDL－C C組

2.3 原花青素對(duì)HLP大鼠血清瘦素、抵抗素、APN及TNF－α、IL－6水平的影響 H組大鼠血胰島素、Leptin、抵抗素水平均較C組顯著增高，而APN水平較C組顯著降低(P＜0.01);原花青素干預(yù)后，低劑量組、高劑量組的胰島素、Leptin水平較H組降低(P＜0.01，P＜0.05);低劑量組的抵抗素水平較H組降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高劑量組的抵抗素水平較H組降低(P＜0.05);高劑量組的APN水平明顯增高(P＜0.01)。H組的血清 TNF－α、IL－6水平均較 C 組顯著增高(P ＜0.01);給予干預(yù)后，低劑量組、高劑量組的血清TNF－α、IL－6水平均較H組顯著降低(P＜0.01)。見(jiàn)表3，表4。

表3 各組血清胰島素、瘦素、抵抗素、脂聯(lián)素水平(±s，n=10)

表3 各組血清胰島素、瘦素、抵抗素、脂聯(lián)素水平(±s，n=10)

與C組比較:1)P＜0.01;與H組比較:2)P＜0.01，3)P＜0.05

組別 胰島素Leptin(ng/ml)抵抗素(μg/L)APN(ng/L)42.13±1.81 0.64±0.33 8.99±0.97 6.00±0.24 H組 93.00±1.751) 1.11±0.601) 12.68±2.191) 5.52±0.301)LD組90.80±1.511)2) 0.81±0.541)3) 10.46±0.151) 5.94±0.51 HD組87.05±1.541)3) 0.76±0.371)3) 10.03±1.072) 6.15±0.223)F值 2 131.052 58.056 837.405 7.908 P值C組0.000 0.000 0.000 0.000

表4 各組血清TNF-α、IL-6水平比較(±s，n=10)

表4 各組血清TNF-α、IL-6水平比較(±s，n=10)

與C組比較:1)P＜0.01;與H組比較:2)P＜0.01

組別 TNF－α(ng/ml) IL－6(pg/ml)對(duì)照組207.448/0.000 23.553/0.000 0.65±0.58 15.02±0.32高脂血癥組 0.91±0.591) 22.06±0.521)低劑量組 0.75±0.461)2) 19.02±0.361)2)高劑量組 0.64±0.502) 17.04±0.361)F/P值

3 討論

HLP是由于脂肪代謝或運(yùn)轉(zhuǎn)障礙使TC、TG和(或)LDL－C過(guò)高和(或)HDL－C過(guò)低而引發(fā)的一種病癥。HLP也是肥胖癥和IR等疾病的主要的危險(xiǎn)因素。高脂飲食可以使血脂含量增加，誘導(dǎo)HLP的發(fā)生。研究表明富含有脂肪的食物使動(dòng)物飽腹感較差，并且高脂飲食使鼠肌肉解偶聯(lián)蛋白3(UCP3)mRNA表達(dá)下調(diào)，使線粒體氧耗量減少，產(chǎn)熱減少，脂肪量增加，最后導(dǎo)致肥胖〔4〕。

原花青素具有極強(qiáng)的抗氧化活性，是一種很好的自由基清除劑和脂質(zhì)過(guò)氧化抑制劑。本文觀察到原花青素可顯著降低高脂大鼠體重、血清TG、TC和LDL－C水平，并且高劑量組可以顯著提高血清HDL－C水平，與一些研究報(bào)道〔5〕相符;并且原花青素干預(yù)后，HLP大鼠血清胰島素水平降低。因此，推斷原花青素的降脂作用對(duì)肥胖和IR有一定的預(yù)防和治療作用。

高脂飲食可以引起脂肪組織增多，促進(jìn)脂肪組織細(xì)胞因子分泌，如瘦素、抵抗素、APN，而后者又調(diào)節(jié)脂代謝及作用于胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)錄及的多個(gè)環(huán)節(jié)而導(dǎo)致IR〔6〕。瘦素來(lái)源于脂肪組織〔7〕，是調(diào)節(jié)脂肪和能量平衡重要的內(nèi)分泌激素，研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)肥胖者體內(nèi)瘦素水平增加，并且與BMI呈正相關(guān)〔8〕。瘦素能夠抑制胰島B細(xì)胞合成和胰島素的分泌。高脂飲食引起脂肪堆積而使瘦素分泌增加，一方面，在長(zhǎng)期高濃度瘦素的刺激下，胰島B細(xì)胞的瘦素受體對(duì)瘦素不敏感，使瘦素對(duì)胰島素合成、分泌的抑制作用下降，導(dǎo)致高胰島素血癥及IR;另一方面，高濃度瘦素可以下調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子－4 mRNA和蛋白的表達(dá)，抑制葡萄糖攝取，減弱周?chē)M織對(duì)葡萄糖敏感性，從而加重IR〔9〕。因此高水平的瘦素可能導(dǎo)致IR。本實(shí)驗(yàn)觀察原花青素干預(yù)后，使HLP大鼠血瘦素水平明顯降低，有利于瘦素正常生理功能的發(fā)揮，抑制食欲、減少能量攝入、增加能量消耗和降低體質(zhì)量，并且調(diào)節(jié)糖代謝的平衡、促進(jìn)脂肪分解和抑制脂肪合成、還調(diào)節(jié)免疫功能。

抵抗素也是由脂肪組織分泌的細(xì)胞因子，在機(jī)體生理代謝與調(diào)節(jié)中起重要作用，其在鼠和人類(lèi)個(gè)體中廣泛分布，具有誘導(dǎo)IR及調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)的作用。研究認(rèn)為，抵抗素主要作用于脂肪細(xì)胞、肝臟、肌肉等胰島素靶器官，抑制靶器官在胰島素刺激下葡萄糖代謝，使周?chē)M織對(duì)胰島素的敏感性降低〔10〕。

APN是目前最明確和重要的一個(gè)具有抗IR作用的脂肪細(xì)胞因子，參與糖脂的代謝。實(shí)驗(yàn)證明，APN缺乏或APN基因破壞后，介導(dǎo)的胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)減弱，顯示嚴(yán)重的IR;當(dāng)APN分泌恢復(fù)正常后，上述現(xiàn)象及IR都可得到逆轉(zhuǎn)。表明APN能增加胰島素的敏感性〔11〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明高脂飲食誘導(dǎo)6 w后大鼠血APN水平明顯降低。進(jìn)一步的研究表明〔12〕，APN刺激的葡萄糖利用和脂肪酸氧化可能是通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)途徑介導(dǎo)完成而達(dá)到抗IR的作用。

TNF－α、IL－6是由多種細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子，可介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分解、細(xì)胞凋亡等，是重要的免疫調(diào)節(jié)因子，也是炎癥免疫反應(yīng)的重要介質(zhì)。有研究顯示，超重和肥胖者血清中IL－6水平增高〔13〕。本實(shí)驗(yàn)顯示TNF－α與其他細(xì)胞因子在不同組織中直接或間接的作用引起IR:直接抑制葡萄轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)蛋白的表達(dá)〔14〕;抑制脂蛋白脂酶活性，使血清FFA水平升高;誘導(dǎo)β細(xì)胞內(nèi)一氧化氮合酶(NOS)的表達(dá)，使β細(xì)胞內(nèi)NOS及一氧化氮(NO)增多(NO增多可抑制胰島素信號(hào)和β細(xì)胞的功能);促進(jìn)脂肪組織瘦素的產(chǎn)生及釋放〔15〕。IL－6增加可抑制肝臟產(chǎn)生葡萄糖的能力，導(dǎo)致IR〔16〕;還可與leptin競(jìng)爭(zhēng)相同的信號(hào)傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致leptin抵抗，使leptin對(duì)胰島素分泌的抑制作用減弱，造成高胰島素血癥及 IR〔17〕;還有研究發(fā)現(xiàn)，IL－6增高會(huì)引起VLDL、TG增高〔18〕。故IL－6在肥胖和IR的發(fā)生發(fā)展中具有一定的作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示原花青素通過(guò)直接調(diào)節(jié)胰島素水平及間接調(diào)節(jié)血清瘦素、抵抗素、APN、TNF－α和 IL－6水平的作用，在防治高脂血癥誘導(dǎo)肥胖及IR的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

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