周華山 陳 祥 趙 明 胡火珍

(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610064)

染色體是遺傳物質(zhì)的載體，生物的染色體非常穩(wěn)定，不同物種的染色體都有各自特定的形態(tài)結(jié)構(gòu)(包括染色體的長(zhǎng)度、著絲點(diǎn)位置、臂比、隨體大小等)特征。染色體組型分析是細(xì)胞遺傳學(xué)研究的基本方法，是研究物種演化、分類(lèi)以及染色體結(jié)構(gòu)、形態(tài)與功能之間的關(guān)系不可缺少的重要手段。其研究已成為動(dòng)物遺傳、育種、病理、繁殖等學(xué)科中的一個(gè)非常重要的課題。染色體的制備最常用的途徑是從骨髓細(xì)胞中制備染色體，此法不需無(wú)菌操作，設(shè)備簡(jiǎn)單，所用時(shí)間較短，適于大多數(shù)的動(dòng)物體。鼠四肢骨內(nèi)骨髓細(xì)胞中的造血干細(xì)胞是生成各種血細(xì)胞和原始細(xì)胞，具有高度的分裂能力。本實(shí)驗(yàn)采用這一材料，通過(guò)前處理，低滲，固定，制片，染色等步驟制得染色體標(biāo)本，可觀察到許多處于分裂中期的染色體，進(jìn)行染色體組型分析。

同工酶是指同一種屬中不同基因位點(diǎn)或同一位點(diǎn)的復(fù)等位基因編碼的多肽鏈所組成的單體、純聚體或雜交體。同工酶存在同一個(gè)體或同一組織中，在生理上、免疫學(xué)上、理化性質(zhì)上都存在差異。由于酶是基因編碼的產(chǎn)物，它在電場(chǎng)中遷移率的改變反映了酶蛋白的大小構(gòu)形和肽鏈氨基酸的序列變化，即編碼DNA順序上的變化，所以可通過(guò)分析酶譜的變化來(lái)獲得我們所需要的遺傳信息。同工酶在臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用上可能在細(xì)胞癌變過(guò)程中有多種同工酶譜發(fā)生變化。細(xì)胞同工酶分析可用來(lái)鑒定細(xì)胞種屬，此外，因同工酶譜有臟器特異性，故同工酶常可較特異地反映某一臟器的病變。同工酶有多種類(lèi)型，通常以乳酸脫氫酶(LDH)、核苷磷酸化酶(NP)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)、蘋(píng)果酸脫氫酶(MD)等幾種酶譜作為常用分析指標(biāo)。由于同工酶的研究是從基因產(chǎn)物認(rèn)識(shí)基因的存在，由生化表現(xiàn)型反映基因型，因此，同工酶已廣泛應(yīng)用到生物的遺傳育種，動(dòng)植物的分類(lèi)及進(jìn)化，臨床檢驗(yàn)以及診斷某些疾病等研究領(lǐng)域中〔1〕。本文通過(guò)優(yōu)化的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離供試細(xì)胞株和倉(cāng)鼠四種不同臟器同工酶，對(duì)倉(cāng)鼠及幾種小鼠染色體組型及倉(cāng)鼠不同組織同工酶進(jìn)行了分析，初步探討倉(cāng)鼠與C57小鼠和ICR小鼠間的差異。同時(shí)揭示了同工酶在不同臟器組織中的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 材料 中國(guó)倉(cāng)鼠購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所;C57小鼠和ICR小鼠由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供;常用試劑均購(gòu)于成都奧克生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 鼠骨髓細(xì)胞染色體制備方法 本文染色體制備操作方法參照四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院編寫(xiě)的實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)〔2〕及部分文獻(xiàn)報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方案〔3～6〕。

1.2.1.1 收集骨髓有核細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)前4～5 h，將鼠稱(chēng)重后按100 μg/10 g體重從腹部注入適量體積的秋水仙素溶液，斷頸處死，用剪刀剝?nèi)『笸裙晒呛兔劰牵啿既コ砻婕∪?，再用骨鉗剪去兩端，用注射器抽取PBS緩沖液沖洗骨髓腔，細(xì)胞收集于離心管中。反復(fù)沖洗幾次至骨腔變白為止;離心1 000 r/min 8 min，去上清。

1.2.1.2 低滲處理 向離心管中加入8 ml于39℃預(yù)熱的0.075 mol/L KCl低滲液，置于39℃水浴鍋中35 min;離心1 000 r/min 8 min。

1.2.1.3 固定 低滲結(jié)束前1 min，向離心管中加入1 ml固定液行預(yù)固定，然后經(jīng)1 000 r/min離心8 min，吸去上清液，加入3∶1甲醇-冰醋酸固定液至8 ml刻度，用吸管輕輕吹散細(xì)胞沉淀塊，放入39℃水浴鍋中20 min。

1.2.1.4 滴片 固定結(jié)束后，離心1 000 r/min 8 min，去上清，在留有細(xì)胞沉淀的離心管內(nèi)加入1 ml固定液將細(xì)胞吹打均勻，取冰水預(yù)冷的濕玻片滴片(距離玻片上方至少30 cm高處)，每片滴3～4滴后迅速吹散細(xì)胞，置酒精燈上微烤，放玻片架自然晾干。

1.2.1.5 染色 晾干后的玻片置1∶9 Giemsa染液染色10～15 min，取出后用蒸餾水或自來(lái)水沖片，自然晾干。

1.2.1.6 鏡檢 將破片置于顯微鏡下觀察染色體制備情況，找出分裂相比較好的視野拍照，并計(jì)數(shù)染色體數(shù)目。

1.2.2 中國(guó)倉(cāng)鼠肝、腎、心、脾四種組織及CHO細(xì)胞同工酶分析

1.2.2.1 細(xì)胞及組織蛋白提取 取中國(guó)倉(cāng)鼠肝、腎、心、脾四種臟器，保存于液氮中。提取總蛋白時(shí)從液氮中取出臟器，放入勻漿器內(nèi)，加入少許細(xì)胞裂解液并充分勻漿。冷凍離心機(jī)中14 000 r/min離心15 min收集上清備用。生長(zhǎng)于培養(yǎng)瓶中的CHO細(xì)胞收集于離心管中，用PBS緩沖液清洗幾遍后轉(zhuǎn)移入1.5 ml EP管中，向其中加入1 ml細(xì)胞裂解液。然后用液氮反復(fù)凍融3～5次，使細(xì)胞完全破碎，完畢后于冷凍離心機(jī)中14 000 r/min離心15 min收集上清用于后續(xù)電泳分析。

1.2.2.2 電泳及顯色 凝膠制備:采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，由于不能讓蛋白變性，所以電泳系統(tǒng)中不允許變性劑的存在。PAGE配方與SDS-PAGE配方相同，但需將其中的變性劑SDS去掉〔7〕。采用8%和12%的凝膠就能達(dá)到較好的分離效果。電泳條件也與SDS-PAGE相同，具體操作步驟可查閱相關(guān)文獻(xiàn)〔8〕。顯色:電泳結(jié)束后，關(guān)閉電源，取出膠板用清水沖洗幾遍，放入染色盒內(nèi)，然后倒入預(yù)先配制的顯色液淹沒(méi)整個(gè)膠片。之后將染色盒置于37度培養(yǎng)箱中顯色。各個(gè)酶的染色液配方見(jiàn)下表〔8，9〕。

1.2.2.3 固定照膠 當(dāng)凝膠片上出現(xiàn)染色條帶后即可停止染色，小心取出膠片放入培養(yǎng)皿中，加入酶固定液作用一定時(shí)間，然后可在凝膠成像儀上拍照存檔。

表1 各個(gè)酶系統(tǒng)染色液配方

2 結(jié)果

2.1 經(jīng)滴片染色后可于顯微鏡下觀察到染色體分型情況 本實(shí)驗(yàn)所用中國(guó)倉(cāng)鼠，經(jīng)骨髓細(xì)胞染色體制備觀察到其染色體數(shù)為2n=28，中著絲粒染色體，近中著絲粒染色體和端著絲粒染色體均存在于細(xì)胞分裂相中(見(jiàn)圖1)。而C57小鼠和ICR小鼠的染色體為2n=40，均為端著絲粒染色體(見(jiàn)圖2和圖3)。

圖1 倉(cāng)鼠骨髓細(xì)胞染色體制備(2n=28)

圖2 C57小鼠骨髓細(xì)胞染色體制備(2n=40)

圖3 ICR小鼠骨髓細(xì)胞染色體制備(2n=40)

圖4 細(xì)胞株及四種臟器組織同工酶顯色條帶

2.2 同工酶分析顯示不同組織三種酶表達(dá)情況 從CHO細(xì)胞和四種組織中提取的總蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，浸于對(duì)應(yīng)的酶系統(tǒng)染色液中染色，即可在膠片上出現(xiàn)特異條帶。LDH表達(dá)量高，出現(xiàn)條帶的時(shí)間稍快，2 min便出現(xiàn)條帶。LDH在四種臟器組織中均有表達(dá)，且在腎、心和脾臟中有較高含量，并出現(xiàn)了四條帶，表現(xiàn)不同的同工酶亞型;G6PD和NP顯帶時(shí)間較長(zhǎng)，需要30 min左右，在各個(gè)組織中也有不同程度的表達(dá)(圖4)。

3 討論

動(dòng)物的染色體穩(wěn)定，不同物種的染色體都有各自特定的形態(tài)結(jié)構(gòu)(包括染色體的長(zhǎng)度、著絲點(diǎn)位置、臂比、隨體大小等)特征，而且這種形態(tài)特征是相對(duì)穩(wěn)定的。染色體組型分析是研究物種演化、分類(lèi)以及染色體結(jié)構(gòu)、形態(tài)與功能之間的關(guān)系不可缺少的重要手段。

在生物學(xué)中，同工酶可用于研究物種進(jìn)化、遺傳變異、雜交育種和個(gè)體發(fā)育、組織分化等。同工酶的特征為屬內(nèi)種的分類(lèi)和親緣演化關(guān)系可提供更多的證據(jù)。在醫(yī)學(xué)方面，同工酶是研究癌瘤發(fā)生的重要手段，癌瘤組織的同工酶譜常發(fā)生胚胎化現(xiàn)象，即合成過(guò)多的胎兒型同工酶。此外，因同工酶譜有臟器特異性，故同工酶?？奢^特異地反映某一臟器的病變。

本課題采用染色體及同工酶分析探討幾種常用實(shí)驗(yàn)小鼠細(xì)胞遺傳特性及同工酶的組織特異性。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)中國(guó)倉(cāng)鼠、C57小鼠和ICR小鼠雖然都是小鼠，但是染色體組型不同，中國(guó)倉(cāng)鼠是2n=28，后兩種小鼠則是2n=40，染色體組中染色體的形態(tài)也不一樣，中國(guó)倉(cāng)鼠染色體呈“X”形，可見(jiàn)明顯的著絲粒，中著絲、近中著絲粒及近端著絲染色體均存在。而C57和ICR鼠均為端著絲粒染色體，呈“U”形，染色體較小，分散均勻。從該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，小鼠不同種屬染色體數(shù)目并不相同，因此表現(xiàn)出不同的表型。

同工酶分析發(fā)現(xiàn)，LDH含量較其他兩種酶高，染色時(shí)出現(xiàn)條帶的時(shí)間也稍短，2 min便出現(xiàn)。LDH在四種臟器組織中均有表達(dá)，且在腎、心和脾臟中含量較高，并出現(xiàn)了四條帶，表現(xiàn)不同的同工酶亞型;G6PD和NP顯帶時(shí)間較長(zhǎng)，需要30 min左右，在各個(gè)組織中也有不同程度的表達(dá)。其中G6PD在腎臟中含量較高，且與細(xì)胞株內(nèi)表達(dá)情況相似。NP在四種臟器組織中的表達(dá)情況與細(xì)胞株的也很相似，幾乎出現(xiàn)在同一大小范圍內(nèi)。

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們作了多項(xiàng)改良，使實(shí)驗(yàn)效果更好。我們制備染色體的方法是以教研室之前優(yōu)化方案為基準(zhǔn)，并在此基礎(chǔ)上做了適當(dāng)改進(jìn)。秋水仙素的量盡量控制在10 μg/g體重效果較好，也有文獻(xiàn)報(bào)道5 μg/g體重為宜〔10〕;低滲時(shí)間比一般處理時(shí)間有所延長(zhǎng)，本實(shí)驗(yàn)處理35 min能達(dá)到較好的制備效果;混勻細(xì)胞時(shí)注意吹打不能用力過(guò)猛，避免使細(xì)胞破碎，染色體提前釋放而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果;滴片時(shí)保證一定的高度以便染色體能充分散開(kāi)而不互相重疊;最后需要注意離心速度不宜太高以免使細(xì)胞提前破碎，太低則可能損失細(xì)胞。染色體制備過(guò)程雖然比較簡(jiǎn)單，但每一步的操作都必須小心謹(jǐn)慎，需要注意的事項(xiàng)也很多，造成失敗的原因也很多〔11，12〕，所以需要牢記實(shí)驗(yàn)步驟按部就班的操作。

同工酶分析亦可用于體外培養(yǎng)細(xì)胞間交叉污染的鑒定。同工酶分析實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，保證蛋白質(zhì)的活性是關(guān)鍵。因此電泳系統(tǒng)中必須去除變性劑等可能使蛋白變性的因素以及提取蛋白過(guò)程中應(yīng)盡量在低溫環(huán)境下進(jìn)行。保持蛋白的活性是同工酶特異染色的基礎(chǔ)，否則電泳后的膠片將無(wú)法在染色液的作用下顯示相應(yīng)的條帶。本實(shí)驗(yàn)的酶系統(tǒng)染色液配方綜合了文獻(xiàn)報(bào)道的幾種染色方案，最終也證明仍然能夠達(dá)到較好的效果，此染色方案可以作為其他實(shí)驗(yàn)室同工酶分析實(shí)驗(yàn)者的參考。

1 王志宏，曾科文.鴿子組織LDH同工酶電泳分析〔J〕.哈爾濱師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào)，1998;14(2):86-8.

2 李 虹.醫(yī)學(xué)生物學(xué)與醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)〔M〕.北京:科學(xué)出版社，2007:56-9.

3 林 穎，姜 芬.動(dòng)物細(xì)胞染色體制備實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)〔J〕.福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006;36(2):228-9.

4 唐桂容，石紅艷.兩棲動(dòng)物骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本制備方法的改進(jìn)〔J〕.綿陽(yáng)師范學(xué)院報(bào)，2008;27(8):78-81.

5 趙淑娟，龐有志，白俊艷，等.禽類(lèi)骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本制備實(shí)驗(yàn)方法的改進(jìn)〔J〕.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2010;27(2):17-24.

6 唐慕湘，張興華，陳家強(qiáng)，等.小鼠染色體制備方法初探〔J〕.解剖學(xué)研究，2011;33(2):160-1.

7 陳毓荃編.生物化學(xué)試驗(yàn)方法和技術(shù)〔J〕.北京:科學(xué)出版社，2002:36-7.

8 李 岑，張國(guó)榮.動(dòng)物細(xì)胞同工酶檢測(cè)方法的改良及其應(yīng)用〔J〕.中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)，2007;2(1):54-6.

9 梁裕芬，韋俊彬，運(yùn)晨霞，等.陰道毛滴蟲(chóng)和口腔毛滴蟲(chóng)5種同工酶譜對(duì)比分析〔J〕.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010;32(11):1180-2.

10 譚秀華，梁 磊.秋水仙素對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞有絲分裂的影響〔J〕.中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2007;1(5):6-7.

11 劉涌濤，馬全詳，劉慧娟.小鼠骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本制備中的失誤與對(duì)策.生物學(xué)通報(bào)，2003;38(6):53-4.

12 黃 燕，趙小平，余 紅，等.動(dòng)物骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本制備失敗的原因分析〔J〕.生物學(xué)通報(bào)，2006;41(1):52-3.