張寶輝 方秀斌 劉曉湘 (中國醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110001)

現(xiàn)代的觀點(diǎn)認(rèn)為，支氣管哮喘是一種慢性炎癥疾病，而隨著分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和病理學(xué)等技術(shù)的深入發(fā)展，證實(shí)了呼吸道廣泛存在神經(jīng)肽網(wǎng)，神經(jīng)異常機(jī)制也越來越受到重視，認(rèn)為炎癥可影響神經(jīng)和神經(jīng)肽調(diào)控機(jī)制，而神經(jīng)機(jī)制又反過來影響炎癥機(jī)制。由于支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，其病理機(jī)制至今尚未完全闡明。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)是繼神經(jīng)生長因子(NGF)后發(fā)現(xiàn)的第2個(gè)神經(jīng)營養(yǎng)因子，研究發(fā)現(xiàn)，在人的氣道平滑肌內(nèi)，BDNF能上調(diào)Ca2+含量，認(rèn)為BDNF很可能通過調(diào)節(jié)Ca2+含量來調(diào)節(jié)氣道平滑肌收縮，參與哮喘等氣道疾病〔1〕。另有研究證實(shí)，BDNF水平在過敏性哮喘未治療組比健康對(duì)照組、吸入糖皮質(zhì)激素治療組明顯升高，有效的治療可降低血液循環(huán)中的BDNF水平，表明BDNF參與過敏性哮喘〔2〕。但BDNF能否通過調(diào)節(jié)p-CREB、CREB分子的表達(dá)參與哮喘仍未見文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在檢測(cè)BDNF被阻斷后，小鼠C7～T5節(jié)段脊髓后角內(nèi)p-CREB、CREB的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型制備 雌性BALB/c小鼠30只，由首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。按隨機(jī)數(shù)字表法分組，每組10只。(1)哮喘組第1天每只小鼠腹腔注射20 μg OVA(Sigma公司)和2 mg氫氧化鋁混合于0.5 ml PBS中;第8、15天每只小鼠腹腔注射10 μg OVA和1 mg氫氧化鋁混合于0.5 ml PBS中;第16天開始將小鼠置于封閉容器中，給予4%OVA(PBS配成)霧化吸入激發(fā)哮喘發(fā)作，每天1次，每次25 min，連續(xù)7 d。(2)ANTI-BDNF組，第19天開始霧化吸入前3 h鼻腔給BDNF抗體，其余均與哮喘組相同。(3)正常對(duì)照組，以PBS代替OVA注射和霧化吸入，其余均與哮喘組相同。各組最后一次激發(fā)后24 h處死。

1.2 AniRes2005肺功能儀測(cè)氣道反應(yīng)性 用0.4%的戊巴比妥鈉腹腔麻醉小鼠(80 mg/kg)，疼痛反射消失后固定在小鼠體描箱內(nèi)操作臺(tái)上，氣管插管，呼吸比 15∶10，呼吸頻率90次/min，游離頸外靜脈，行靜脈穿刺，固定針柄，封閉體描箱。乙酰甲膽堿(mAch)用磷酸緩沖液(0.1 mol/L pH7.4)配成0.025、0.05、0.075、0.1 mg/kg，經(jīng)頸外靜脈各注射 0.1 ml，記錄波形和數(shù)據(jù)。

1.3 免疫熒光 動(dòng)物用0.4%的戊巴比妥鈉腹腔麻醉(40 mg/kg體重)，用4%多聚甲醛灌流固定，將組織塊固定24 h，移入30%蔗糖緩沖液中至標(biāo)本下沉，OCT包埋，恒冷箱切片機(jī)連續(xù)切片(片厚8 μm)。冷風(fēng)干燥后，室溫下血清封閉20 min，甩干;滴加一抗 p-CREB、CREB(購自 Santa Cruz公司)工作濃度為1∶150，4℃孵育過夜;PBS充分洗滌，滴加工作濃度為1∶100 FITC標(biāo)記的二抗(購自Sant Crutz公司)，孵育40 min;PBS充分洗滌，甘油封片。用OlympusBX51型熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，綠色熒光為陽性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 哮喘模型制作結(jié)果 正常對(duì)照組霧化吸入生理鹽水后無明顯哮喘反應(yīng);哮喘組動(dòng)物在霧化吸入卵蛋白3次后，大部分哮喘發(fā)作，表現(xiàn)為呼吸頻率加深加快，肋間隙凹陷，刺激性嗆咳;ANTI-BDNF組動(dòng)物，前3次霧化吸入卵蛋白后，大部分哮喘發(fā)作，應(yīng)用BDNF抗體阻斷后，誘喘反應(yīng)不明顯。

2.2 AniRes2005肺功能儀測(cè)氣道阻力 哮喘組小鼠對(duì)mAch的濃度反應(yīng)曲線明顯上移，其呼氣阻力和吸氣阻力顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.01)，證明哮喘小鼠對(duì)mAch的氣道反應(yīng)性顯著高于正常小鼠，證明哮喘模型建立成功;anti-BDNF組對(duì)mAch的濃度反應(yīng)曲線明顯低于哮喘組(P＜0.01)，提示在經(jīng)鼻腔滴加BDNF抗體后，哮喘小鼠的氣道高反應(yīng)降低(圖1)。

2.3 免疫熒光結(jié)果 CREB的檢測(cè)結(jié)果:從圖2上可以看出，哮喘組小鼠的C7～T5節(jié)段脊髓后角的CREB蛋白表達(dá)量顯著高于于正常對(duì)照組小鼠的表達(dá)，顯微圖像分析表明，哮喘組CREB陽性反應(yīng)產(chǎn)物MOD值明顯高于對(duì)照組(P＜0.01);相比于哮喘組，anti-BDNF組小鼠在經(jīng)鼻滴加BDNF抗體后，C7～T5節(jié)段脊髓后角的CREB表達(dá)量明顯低于哮喘組的表達(dá)量，顯微圖像分析表明，anti-BDNF組CREB陽性反應(yīng)產(chǎn)物MOD值明顯低于哮喘組(P＜0.01)。

p-CREB的檢測(cè)結(jié)果:從圖3可以看出，哮喘組小鼠的C7-T5節(jié)段脊髓后角的p-CREB蛋白表達(dá)量顯著高于于正常對(duì)照組小鼠的表達(dá);顯微圖像分析表明，哮喘組p-CREB陽性反應(yīng)產(chǎn)物MOD值明顯高于對(duì)照組(P＜0.01);相比于哮喘組，anti-BDNF組小鼠在經(jīng)鼻滴加BDNF抗體后，C7～T5節(jié)段脊髓后角p-CREB的表達(dá)量明顯低于哮喘組的表達(dá)量;顯微圖像分析表明，anti-BDNF組p-CREB陽性反應(yīng)產(chǎn)物MOD值明顯低于哮喘組(P＜0.01)。見表1。

圖1 Ani Res2005肺功能儀檢測(cè)氣道阻力

圖2 免疫熒光方法檢測(cè)各組小鼠CREB的表達(dá)(×200)

圖3 免疫熒光方法檢測(cè)各組小鼠p-CREB的表達(dá)(×200)

表1 各上鼠CREB、p-CREB的光密度值(±s)

表1 各上鼠CREB、p-CREB的光密度值(±s)

與哮喘組比較:1)P＜0.01

CREB p-CREB正常對(duì)照組 17.43±2.361) 16.41±1.961)組別哮喘組 35.46±3.25 32.38±3.19 anti-BDNF組 29.16±3.081) 26.15±2.681)

3 討論

支氣管哮喘是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的反復(fù)發(fā)作的可逆性氣流受限和氣道高反應(yīng)性為特征的氣道慢性非特異性炎癥性疾病，我國哮喘發(fā)病率為1%，其中兒童達(dá)3%。近年來支氣管哮喘與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的研究一直受到國內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)哮喘發(fā)生不僅僅與免疫炎癥相關(guān)，同時(shí)神經(jīng)系統(tǒng)也參與了哮喘的發(fā)病。但對(duì)于他們之間的相互作用及其機(jī)制尚不完全清楚。

BDNF是繼NGF后發(fā)現(xiàn)的第2個(gè)神經(jīng)營養(yǎng)因子，二者同屬于NGF家族。研究發(fā)現(xiàn)，在過敏性疾病中，氣道上皮細(xì)胞高表達(dá)NGF和BDNF，而這些神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)可以延長組織嗜酸性粒細(xì)胞的存活，從而加重哮喘等過敏性疾病的發(fā)病過程。而在過敏性哮喘患者血漿、血清、血小板中BDNF水平比對(duì)照組明顯升高，并與氣道阻塞、氣道高反應(yīng)性有關(guān)，糖皮質(zhì)激素可通過活化的免疫細(xì)胞抑制BDNF產(chǎn)生〔3〕。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，BDNF可影響慢性氣道阻塞和局部神經(jīng)元高反應(yīng)性，在應(yīng)用沙美特羅(β2促效劑，擴(kuò)張支氣管)治療哮喘時(shí)，血清和血小板的BDNF濃度被顯著上調(diào)〔4〕。綜上可知，BDNF在哮喘發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。但是BDNF是通過哪些信號(hào)通路參與哮喘發(fā)病，在哮喘發(fā)病機(jī)制中具體發(fā)揮何種作用尚需進(jìn)一步研究。

cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)是在研究生長抑素(somaostatin)基因的表達(dá)與調(diào)節(jié)時(shí)發(fā)現(xiàn)的，生長抑素基因的表達(dá)受cAMP信號(hào)的調(diào)控，對(duì)該基因5'端上游區(qū)域的研究發(fā)現(xiàn)，8個(gè)堿基對(duì)的回文序列5'-TGACGTCA-3'，決定cAMP誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)發(fā)生，這一元件被稱為cAMP反應(yīng)元件(cAMP-response element，CRE)。繼而在尋找識(shí)別CRE模體的蛋白因子的過程中發(fā)現(xiàn)了43kD的CREB，CREB作為細(xì)胞內(nèi)的第三信使，定位于細(xì)胞核內(nèi)。在神經(jīng)系統(tǒng)中，很多細(xì)胞外刺激物能夠激活CREB及其家族成員，有賴于CREB轉(zhuǎn)錄的基因表達(dá)參予了從疾病發(fā)生到轉(zhuǎn)變的復(fù)雜而多樣的過程。在生長因子和其他刺激物調(diào)控的廣泛的系列過程如:神經(jīng)元細(xì)胞的增殖、生長、存活，神經(jīng)元生長過程中的突出連接等中起著重要作用，而且在大腦學(xué)習(xí)與記憶、神經(jīng)元保護(hù)、某些疾病的發(fā)病中也起著非常重要的作用〔5～7〕。但BDNF能否通過調(diào)節(jié)p-CREB、CREB分子的表達(dá)參與哮喘仍未見文獻(xiàn)報(bào)道。

從免疫熒光結(jié)果可以看出，哮喘組小鼠的C7-T5節(jié)段脊髓后角的CREB、p-CREB蛋白表達(dá)量顯著高于于正常對(duì)照組，相比于哮喘組，anti-BDNF組小鼠在經(jīng)鼻滴加BDNF抗體后，C7-T5節(jié)段脊髓后角的CREB、p-CREB的表達(dá)量明顯降低，而在應(yīng)用AniRes2005肺功能儀對(duì)各組小鼠進(jìn)行氣道阻力測(cè)定時(shí)也發(fā)現(xiàn)，anti-BDNF組對(duì)mAch的濃度反應(yīng)曲線明顯低于哮喘組，提示在經(jīng)鼻腔滴加BDNF抗體后，哮喘小鼠的氣道高反應(yīng)降低，這結(jié)果提示BDNF很可能是通過上調(diào)CREB的表達(dá)來參與哮喘發(fā)病機(jī)制。

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