劉 洋 李 浪 周 游 王江友 蘇 強(qiáng) 孫羽涵

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，廣西 南寧 530021)

他汀類藥物是動脈粥樣硬化性疾病的主要治療藥物，除明顯改善血脂異常外，尚具有獨(dú)立于降脂作用之外的多效性作用，其中抗炎特性最引人注目。研究表明，阿托伐他汀抑制CD4+T細(xì)胞的增殖，使 Th1分泌的細(xì)胞因子 IFN-γ、TNF-α減少，Th2分泌的細(xì)胞因子IL-4、IL-10分泌增多，從而調(diào)整Th1/Th2亞群平衡〔1，2〕。然而阿托伐他汀抑制CD4+T淋巴細(xì)胞炎癥反應(yīng)的具體機(jī)制尚未完全清楚。越來越多的研究表明，微小核糖核酸(microRNA)參與了免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，在活化的CD4+T淋巴細(xì)胞中miRNA-21表達(dá)明顯上調(diào)〔3〕，miRNA-21能夠通過抑制靶蛋白程序性細(xì)胞死亡因子4(PDCD4)的表達(dá)使IL-10分泌增多而起到抗炎作用〔4〕。本研究旨在了解阿托伐他汀對人CD4+T淋巴細(xì)胞miRNA-21表達(dá)的影響，從而進(jìn)一步揭示他汀類藥物的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料 Dynabeads?FlowCompTMHuman CD4試劑盒購自 Dynal公司，RPMI1640培養(yǎng)基購自 Hyclone公司，TRNzol-A+總RNA提取試劑購自北京天根公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司，熒光定量試劑盒購自Rox公司，miRNAQ-PCR檢測試劑盒購自GeneCopoeia公司，microRNA-21、U6引物由GeneCopoeia公司提供，PDCD4mRNA、GAPDHmRNA引物由上海生工公司合成，兔抗人PDCD4單抗購自Abcam公司，羊抗兔熒光二抗購自LI-COR公司，GAPDH單抗購自碧云天公司，人TNF-α ELISA試劑盒購自ebioscience公司，人IL-10超敏ELISA試劑盒購自Neobioscience公司。

1.2 細(xì)胞提取與分組 取12例健康志愿者新鮮外周血，按根據(jù)Ficoll-Paque密度梯度離心法提取PBMC細(xì)胞，重懸于1 ml 1640培養(yǎng)基，嚴(yán)格按照Dynabeads?FlowCompTMHuman CD4磁珠分選試劑盒說明書分選人CD4+T淋巴細(xì)胞。從分選出的細(xì)胞中取10 ml+90 ml PBS做細(xì)胞計(jì)數(shù)，同時(shí)用0.4%臺盼藍(lán)染色觀察并計(jì)算出活細(xì)胞存活率。存活率＞90%的CD4+T淋巴細(xì)胞調(diào)整為1×106/ml，接種到6孔板中，每孔2 ml。分為①空白組:加等量1640培養(yǎng)基;②刺激組:加5 μg/mlPHA;③他汀藥物干預(yù)組:分別加入不同濃度阿托伐他汀(終濃度為0、1、5、10 μmol/L)，先加PHA刺激1 h后再加阿托伐他汀。用含10%胎牛血清、100 U/ml青鏈霉素、2 μmol/Lol/L的谷氨酰胺的改良型1640培養(yǎng)基，在5%CO2、37℃孵育48 h，分別離心取培養(yǎng)基上清和細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測各組細(xì)胞miRNA-21和PDCD4 mRNA的表達(dá) 按照Trizol操作說明提取細(xì)胞的總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。采用SYBR Green Ι熒光標(biāo)記法檢測PCR產(chǎn)物，總反應(yīng)體系為20 μl，根據(jù)熒光定量PCR說明書分別加入不同組分，miRNA-21及內(nèi)參U6引物由GeneCopeia公司提供(引物ID分別為:hsmq-0057和hsnRNAU6)，PDCD4引物:上游:5'-AACTGTGCCAACCAGTCCAA-3'，下 游:5'-TCTTCTCAAATGCCCTTTCATC-3';GAPDH引物:上游:5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'，下游:5'-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3'。按試劑盒說明設(shè)置反應(yīng)體系及參數(shù)，每個(gè)樣本均做復(fù)孔檢測，同時(shí)每次反應(yīng)均設(shè)置陰性孔。結(jié)果采用2－ΔΔCT方法比較。

1.4 Western印跡檢測各組PDCD4蛋白的表達(dá) 分選出的CD4+T淋巴細(xì)胞中加入100 μl蛋白裂解液混勻，然后在4℃下12 000 r/min離心20 min。提取上清轉(zhuǎn)移至新離心管中，然后用BCA法檢測蛋白濃度，內(nèi)參為GAPDH。配置12%分離膠和5%濃縮膠，進(jìn)行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干法轉(zhuǎn)膜 40 min，用 TBST配置的 5%脫脂奶粉封閉 1 h，1∶2 500一抗4℃過夜，脫色搖床上用TBST洗膜5 min×5次，1∶5 000紅外熒光二抗室溫敷育2 h后雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描成像。

1.5 ELISA檢測各組TNF-α和IL-10濃度 將收集的血清標(biāo)本和ELISA試劑盒常溫下放置約30 min，根據(jù)試劑盒說明書操作，于酶標(biāo)儀下讀取450 nm的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣本的濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 阿托伐他汀對miRNA-21和PDCD4 mRNA表達(dá)的影響①與空白組比較，PHA刺激組CD4+T淋巴細(xì)胞miRNA-21和PDCD4 mRNA相對表達(dá)量增加(P＜0.05);②與刺激組比較，加入阿托伐他汀干預(yù)后CD4+T淋巴細(xì)胞miRNA-21相對表達(dá)量進(jìn)一步上調(diào)，且隨著藥物濃度增加，上調(diào)的程度越明顯(P＜0.05);在阿托伐他汀濃度達(dá)10 μmol/L時(shí)miRNA-21相對表達(dá)量最高(P＜0.05);PDCD4 mRNA變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 不同濃度阿托伐他汀對CD4+T淋巴細(xì)胞miR-21及PDCD4 mRNA相對表達(dá)量水平的影響(±s)

表1 不同濃度阿托伐他汀對CD4+T淋巴細(xì)胞miR-21及PDCD4 mRNA相對表達(dá)量水平的影響(±s)

與空白組比較:1)P＜0.05;與PHA刺激組比較:2)P＜0.05

項(xiàng)目 空白組 PHA刺激組PHA+1 μmol/L 組PHA+5 μmol/L 組PHA+10 μmol/L 組miR-21 0.58±0.11 1.02±0.241)1.07±0.21 1.59±0.362)3.39±0.302)PDCD4 2.55±0.69 2.77±0.22 2.94±0.66 3.61±0.73 1.72±0.15

2.2 Western印跡檢測PDCD4蛋白的相對表達(dá)量 ①與空白組(0.15±0.06)比較，PHA刺激組(0.43±0.04)CD4+T淋巴細(xì)胞PDCD4蛋白相對表達(dá)量明顯增多(P＜0.05);②與刺激組比較，經(jīng)阿托伐他汀干預(yù)后PDCD4蛋白相對表達(dá)量減少，且隨著藥物濃度的增加，抑制作用越明顯，在阿托伐他汀濃度為10 μmol/L時(shí)抑制作用最顯著(P ＜0.05)〔1 μmol/L他汀組、5 μmol/L他汀組、10 μmol/L 他汀組分別為(0.41 ± 0.07)，(0.26±0.10)，(0.19±0.03)〕，見圖1。

圖1 不同濃度阿托伐他汀對PDCD4蛋白相對表達(dá)量水平的影響

2.3 ELISA檢測上清TNF-α和IL-10濃度 ①與空白組比較，PHA刺激組培養(yǎng)基上清TNF-α濃度明顯增加(P＜0.05)，IL-10則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。②與刺激組比較，加入阿托伐他汀后TNF-α濃度降低，且隨著藥物濃度的增加，變化越明顯，在阿托伐他汀濃度為10 μmol/L時(shí)抑制作用最顯著(P＜0.05)。③與刺激組比較，加入阿托伐他汀后IL-10的濃度增加，且隨著藥物濃度的增加，變化越明顯，在阿托伐他汀濃度為10 um時(shí)促進(jìn)作用最明顯(P＜0.05)。見表3。

表2 不同濃度阿托伐他汀對培養(yǎng)基上清TNF-α和IL-10濃度的影響(±s，pg/ml)

表2 不同濃度阿托伐他汀對培養(yǎng)基上清TNF-α和IL-10濃度的影響(±s，pg/ml)

53.69±2.96 0.53±0.08 PHA刺激組 164.20±23.331) 0.61±0.26 PHA+1 μmol/L組 125.07±25.98 1.93±0.74 PHA+5 μmol/L組 89.12±13.362) 4.18±0.642)PHA+10 μmol/L 組 66.00 ±12.132) 6.86 ±0.672)IL-10空白組組別 TNF-α

3 討論

他汀類藥物己經(jīng)廣泛應(yīng)用于冠心病的一級和二級預(yù)防。他汀類藥物的臨床益處除了降脂以外，還與能調(diào)節(jié)炎癥、穩(wěn)定斑塊有關(guān)。他汀類藥物能抑制CD4+T淋巴細(xì)胞的增殖起到抑制炎癥反應(yīng)的作用〔5〕?；罨妮o助性T淋巴細(xì)胞(Th)根據(jù)分泌的細(xì)胞因子不同可分為兩類:Th1細(xì)胞主要分泌 IFN-γ、TNF-α，Th2細(xì)胞主要分泌 IL-4、IL-10，Th2細(xì)胞分泌的抗炎因子能抑制Th1細(xì)胞分泌的促炎因子。正常情況下，Th1/Th2細(xì)胞趨于動態(tài)平衡，而冠狀動脈粥樣硬化主要是Th1細(xì)胞過度增殖導(dǎo)致Th1/Th2細(xì)胞失去平衡〔6〕。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-21在活化的CD4+T淋巴細(xì)胞表達(dá)上調(diào)〔3〕。在本實(shí)驗(yàn)中，PHA刺激后與空白組比較，CD4+T淋巴細(xì)胞miRNA-21表達(dá)上調(diào)。

據(jù)報(bào)道，過表達(dá)miRNA-21能夠促進(jìn)IL-10 mRNA表達(dá)增加110%，上清IL-10濃度增加85%〔7〕，抑制miRNA-21表達(dá)可使 TNF-α 表達(dá)增加〔8〕。Lu等〔9〕的研究發(fā)現(xiàn)，抑制 CD4+T 淋巴細(xì)胞miRNA-21表達(dá)能抑制Th2細(xì)胞極化，使CD4+T淋巴細(xì)胞分化偏向Th1，加重Th1介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，表明miRNA-21可以調(diào)控CD4+T淋巴細(xì)胞亞群Th1/Th2的平衡，從而使促炎-抑炎因子的分泌保持平衡。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著阿托伐他汀藥物濃度的增加，CD4+T淋巴細(xì)胞miRNA-21表達(dá)量增加，培養(yǎng)基上清IL-10濃度增加，TNF-α濃度明顯降低，提示阿托伐他汀能夠調(diào)整Th1/Th2細(xì)胞分泌促炎因子和抗炎因子趨于平衡可能是通過調(diào)控miRNA-21起效。

PDCD4既往被認(rèn)為是促炎因子，Anja等〔10〕研究顯示，敲除小鼠PDCD4基因后，小鼠淋巴細(xì)胞分泌IL-10、IL-4抗炎因子明顯增多，而IL-10能夠抑制TNF-α分泌，表明PDCD4可能促進(jìn)炎癥發(fā)生。Merline〔11〕研究發(fā)現(xiàn)增加PDCD4表達(dá)，能夠促進(jìn)炎癥信號的活化。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，PHA刺激CD4+T淋巴細(xì)胞后PDCD4mRNA和PDCD4蛋白相對表達(dá)量均顯著增加，培養(yǎng)基上清 TNF-α濃度也明顯增多，提示 PDCD4參與CD4+T淋巴細(xì)胞的炎癥反應(yīng)過程。

既往研究證實(shí)，miRNA-21的靶基因之一是 PDCD4〔12〕，主要為轉(zhuǎn)錄后負(fù)調(diào)控蛋白的表達(dá)。Sheedy等〔4〕研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-21可以下調(diào)PDCD4，從而使抑炎因子IL-10表達(dá)增加，抑制促炎因子TNF-α表達(dá)，限制過度激活的炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在不同濃度阿托伐他汀組中CD4+T淋巴細(xì)胞miRNA-21表達(dá)上調(diào)后，其靶蛋白PDCD4相對表達(dá)量顯著減少，培養(yǎng)基上清的TNF-α濃度明顯降低，IL-10濃度明顯增加。提示miRNA-21可能通過抑制其靶蛋白PDCD4表達(dá)，促進(jìn)抗炎因子IL-10的分泌，抑制TNF-α的表達(dá)，從而調(diào)控CD4+T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

本研究亦發(fā)現(xiàn)，隨著阿托伐他汀藥物濃度的增加，CD4+T淋巴細(xì)胞miRNA-21相對表達(dá)量逐步上調(diào)，靶蛋白PDCD4相對表達(dá)量則逐步降低，促炎因子TNF-α濃度減少，抗炎因子IL-10濃度則增加，在藥物濃度達(dá)10 μmol/L時(shí)作用最顯著，表明阿托伐他汀調(diào)整CD4+T淋巴細(xì)胞抗炎因子和促炎因子平衡與促進(jìn)CD4+T淋巴細(xì)胞miRNA-21的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，阿托伐他汀能夠促進(jìn)miRNA-21表達(dá)增加，抑制其靶蛋白PDCD4表達(dá)，從而調(diào)控CD4+T淋巴細(xì)胞分泌抗炎因子與促炎因子平衡?？赡苁前⑼蟹ニ∫种艭D4+T淋巴細(xì)胞炎癥反應(yīng)的機(jī)制之一。

本研究為他汀的抗炎作用提供了新的視角。然而本實(shí)驗(yàn)僅用了阿托伐他汀為實(shí)驗(yàn)用藥，對于其他他汀類藥物是否有同樣作用尚需進(jìn)一步研究。

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