李曉飛 婁方明 晏 容 侯曉暉 張 恒 劉 云 (遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563003)

斑蝥味辛，性溫，有大毒，是我國首先發(fā)現(xiàn)的一種具有抗腫瘤作用的昆蟲類藥物〔1〕。現(xiàn)代藥學(xué)研究表明斑蝥中的主要活性成分是斑蝥素(CA)，能明顯抑制多種動物移植性腫瘤〔2～4〕，對多種腫瘤細胞具有較強的殺傷和抑制作用，如胃癌、肺癌、食管癌、前列腺癌、宮頸癌和喉癌等〔5〕。斑蝥素雖然具有良好的抗癌性能，但其毒性較大，在治療癌癥的同時會引起一系列毒副作用〔6〕。鑒于此，已有研究者合成了一系列斑蝥素衍生物，如去甲斑蝥素和甲基斑蝥胺等，以期達到既保留斑蝥素的抗癌作用，又減輕其毒副作用的效果。為了尋找更多具有抗腫瘤活性的斑蝥素衍生物，課題組以提取自眼斑芫菁體內(nèi)的斑蝥素為原料，自制合成了三種斑蝥素衍生物:斑蝥素酸鎂、斑蝥素酸鉀及斑蝥素酸鈉，并初步考察了其體外抗腫瘤的活性。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑 人肝癌QGY-7703細胞株購自中國科學(xué)院細胞庫。斑蝥素酸鎂、斑蝥素酸鈉和斑蝥素酸鉀由自制斑蝥素合成;RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司;南美胎牛血清、胰蛋白酶購自美國HYCLONE公司;WST-1細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱3131型，美國Thermo公司;Multiskan spectrum酶標儀，美國Thermo公司;超純水制備系統(tǒng)，美國Millipore公司。

1.3 QGY-7703肝癌細胞的培養(yǎng) QGY-7703肝癌細胞用RPMI-1640培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清)，在37℃、5%飽和濕度CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);待細胞生長至對數(shù)生長期，棄培養(yǎng)液，PBS沖洗，0.25%胰蛋白酶37℃消化，于倒置顯微鏡下見細胞間隙增大、胞質(zhì)回縮即終止消化。倒掉胰酶，加入培養(yǎng)液，輕輕吹打至單細胞懸液，備用。

1.4 WST-1法測定細胞毒實驗 調(diào)整細胞濃度為80 000 個/ml，以每孔 100 μl接種于 96 孔板中，置于 37℃、5%飽和濕度CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，次日加入100 μl系列含不同藥物濃度的RPMI-1640培養(yǎng)液，并同時設(shè)無藥對照組(培養(yǎng)液中有細胞)和空白對照組(培養(yǎng)液中無細胞)。每組設(shè)4個復(fù)孔;培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μl WST-1溶液，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h。按照試劑盒方法，檢測波長450 nm，酶標儀檢測每孔的吸光度(OD)值。計算抑制率，并以藥物濃度為橫坐標，細胞生長抑制率為縱坐標繪制回歸曲線，求出半數(shù)抑制濃度(IC50)。抑制率%=〔1－(藥物組OD值－空白對照OD值)/(對照OD值－空白對照OD值)〕×100%。

2 結(jié)果

2.1 斑蝥素酸鎂對肝癌QGY-7703細胞生長的抑制作用 斑蝥素酸鎂對肝癌QGY-7703細胞的生長抑制作用在2.01～32.16 μmol/L范圍內(nèi)與劑量呈正相關(guān)。以藥物濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標作對數(shù)曲線，得回歸方程y=22.808Ln(x)-1.292 8，相關(guān)系數(shù) r為0.991，經(jīng)計算半數(shù)抑制濃度(IC50)為9.48 μmol/L。見表1。

表1 斑蝥素酸鎂對肝癌QGY-7703細胞增殖的影響(±s，n=4)

表1 斑蝥素酸鎂對肝癌QGY-7703細胞增殖的影響(±s，n=4)

組別 斑蝥素酸鎂(μmol/L) OD450(±s) 抑制率(%)0.376±0.011 －無藥對照組 0 0.741±0.021) －T1 2.01 0.682±0.0031) 16.16 T2 4.02 0.634±0.011) 29.32 T3 8.04 0.571±0.0141) 46.58 T4 16.08 0.527±0.0171) 58.63 T5 32.16 0.447±0.0131)空白對照組0 80.55

2.2 斑蝥素酸鈉對肝癌QGY-7703細胞生長的抑制作用 其抑制作用在8.85～141.59 μmol/L范圍內(nèi)與劑量呈正相關(guān)。以藥物濃度為橫坐標抑制率為縱坐標作對數(shù)曲線，得回歸方程y=24.596Ln(x)-36.585，相關(guān)系數(shù)r=0.998 9。經(jīng)計算半數(shù)抑制濃度(IC50)為33.80 μmol/L。見表2。與空白對照組比較:1)P＜0.05，下表同

表2 斑蝥素酸鈉對肝癌QGY-7703細胞增殖的影響(±s，n=4)

表2 斑蝥素酸鈉對肝癌QGY-7703細胞增殖的影響(±s，n=4)

組別 斑蝥素酸鎂(μmol/L) OD450(±s) 抑制率(%)0.393±0.009 －無藥對照組 0 0.752±0.0111) －T1 8.85 0.693±0.0061) 16.43 T2 17.7 0.630±0.0181) 33.98 T3 35.4 0.565±0.0121) 52.09 T4 70.8 0.504±0.0071) 69.08 T5 141.59 0.450±0.0161)空白對照組0 84.12

表3 斑蝥素酸鉀對肝癌QGY-7703細胞增殖的影響(±s，n=4)

表3 斑蝥素酸鉀對肝癌QGY-7703細胞增殖的影響(±s，n=4)

組別 斑蝥素酸鎂(μmol/L) OD450(±s) 抑制率(%)0.361±0.002 －無藥對照組 0 0.753±0.0061) －T1 7.75 0.706±0.0081) 11.99 T2 15.5 0.643±0.0131) 28.06 T3 31.01 0.559±0.0111) 49.49 T4 62.02 0.495±0.0091) 65.82 T5 124.03 0.442±0.0161)空白對照組0 79.34

2.3 斑蝥素酸鉀對肝癌QGY-7703細胞生長的抑制作用 如表3所示，斑蝥素酸鉀對肝癌QGY-7703細胞的生長抑制作用在7.75～124.03 μmol/L范圍內(nèi)與劑量呈正相關(guān)。以藥物濃度為橫坐標抑制率為縱坐標作對數(shù)曲線，得回歸方程y=24.878 Ln(x)－38.495，相關(guān)系數(shù)r=0.994 5。經(jīng)計算半數(shù)抑制濃度(IC50)為 35.04 μmol/L。

3 討論

實驗結(jié)果顯示，斑蝥素酸鎂、斑蝥素酸鈉以及斑蝥素酸鉀對肝癌QGY-7703細胞的生長具有顯著的抑制作用。對肝癌QGY-7703細胞的抑制作用最強的為斑蝥素酸鎂，其次是斑蝥素酸鈉，最弱的是斑蝥素酸鉀。三種斑蝥素鹽類物質(zhì)中研究最多的為斑蝥素酸鈉，且已作為臨床抗癌藥物使用。已有研究報道〔7～9〕斑蝥素酸鈉能有效抑制人肝癌HepG-2細胞增殖而對人正常肝細胞LO2抑制率較小，在臨床上有助于改善中晚期肝癌患者的臨床癥狀和生活質(zhì)量，可減少化療毒副反應(yīng)。本次實驗結(jié)果提示斑蝥素酸鈉對治療肝癌的效果可能沒有斑蝥素酸鎂好，因此課題組在今后的工作中將重點考察斑蝥素酸鎂對肝癌的抑制作用及其機制。

另外，實驗結(jié)果表明斑蝥素酸鈉對肝癌QGY-7703增殖的抑制效果好于斑蝥素酸鉀，但課題組在前期的工作中發(fā)現(xiàn)斑蝥素酸鉀對胃癌SGC-7901細胞的抑制作用要好于斑蝥素酸鈉〔10〕。因此，我們推測三種斑蝥素鹽類物質(zhì)都能有效抑制腫瘤細胞的生長，只是具有選擇性，其選擇性需要進一步探索驗證。此外，三種斑蝥素鹽類物質(zhì)水溶性好均明顯好于斑蝥素，這一性質(zhì)有助于將其開發(fā)成注射劑，應(yīng)用于臨床。

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10 張 恒，李曉飛，陳祥盛.斑蝥素、斑蝥素酸鉀及斑蝥素酸鈉作用胃癌細胞的研究〔J〕.山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報，2011;30(1):52-5.