韓聚強(qiáng) 楊江霞 傅 天 李杰茹 李志麗 (河北醫(yī)科大學(xué)西山校區(qū)生理教研室，河北 石家莊 050200)

食管癌主要死亡原因是術(shù)后轉(zhuǎn)移。大量研究表明，食管癌的形成和轉(zhuǎn)移是一個(gè)多基因、多因子共同作用的結(jié)果。本研究通過(guò)對(duì)食管癌組織中Smad4和MMP-2蛋白表達(dá)的檢測(cè)，探討Smad4和MMP-2表達(dá)與食管癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系及Smad4和MMP-2蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性，為預(yù)測(cè)食管癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移提供客觀參考指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選自河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院2007年7月至2009年12月食管癌患者手術(shù)切除標(biāo)本80例，其中男51例，女29例;年齡43～75歲，中位數(shù)年齡60歲;其中高分化鱗癌34例，中分化鱗癌22例，低分化鱗癌24例;有周?chē)馨徒Y(jié)轉(zhuǎn)移者48例，無(wú)轉(zhuǎn)移者32例。同時(shí)留取癌旁1～2 cm處不典型增生組織27例，取切緣正常黏膜組織12例作對(duì)照?；颊咝g(shù)前均未進(jìn)行任何抗癌治療，所有患者均有完整臨床病理資料，所有標(biāo)本經(jīng)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片備用。

1.2 免疫組織化學(xué)方法 采用SP方法，DAB染色，SP免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司，鼠抗人MMP-2單克隆抗體購(gòu)于北京中山生物技術(shù)有限公司，兔抗人Smad4多克隆抗體購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。用已知陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 免疫組化結(jié)果判斷 MMP-2和Smad4在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，400×光學(xué)顯微鏡下每張切片至少計(jì)數(shù)10個(gè)視野，每個(gè)視野100個(gè)細(xì)胞，按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比分為陽(yáng)性或陰性，(-)無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞或陽(yáng)性細(xì)胞＜5%，(+)陽(yáng)性細(xì)胞＞5%。采用HPIAS-1000病理圖文分析系統(tǒng)，將陽(yáng)性切片上的陽(yáng)性染色信號(hào)轉(zhuǎn)化為灰度進(jìn)行分析。選擇每張免疫組化切片，用組織切片空白處入射光的值作為定標(biāo)。每張切片測(cè)定6個(gè)高倍視野(10×40)中的每個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞的胞質(zhì)或膜的灰度，取平均值作為測(cè)定值，最后以凈灰度值為一張切片的終值，同時(shí)作為統(tǒng)計(jì)值。凈灰度值=間質(zhì)空白處灰度值-癌巢(或上皮)陽(yáng)性細(xì)胞的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 食管癌中MMP-2和Smad4蛋白表達(dá) MMP-2在癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織和切緣正常組織，Smad4在癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織和切緣正常組織(均P＜0.01)，見(jiàn)表1。

2.2 MMP-2和Smad4蛋白表達(dá)與食管癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 MMP-2和Smad4的表達(dá)量與食管癌患者的性別、年齡及癌組織分化程度均無(wú)關(guān)(P＞0.05)，而與癌組織浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期等密切相關(guān)(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 MMP-2與Smad4的相關(guān)分析 在食管癌組織中MMP-2的表達(dá)與Smad4的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。

表1 MMP-2和Smad4在食管上皮各種病變中的表達(dá)(±s)

表1 MMP-2和Smad4在食管上皮各種病變中的表達(dá)(±s)

與其他兩組比較:1)P＜0.01

灰度值正常組織 12 01) 73.145±11.6631)組別 n MMP-2灰度值 Smad4癌旁不典型增生 27 41.574±9.2211) 56.784±14.5801)癌組織 80 64.151±10.6721) 33.360±10.6141)

表2 MMP-2和Smad4在食管癌中的表達(dá)

3 討論

在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程中，由于某些基因的異常表達(dá)及一系列的基因突變，使得一些腫瘤獲得浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移的特性，脫離原發(fā)瘤，穿透基底膜進(jìn)入結(jié)締組織，并侵襲淋巴管和血管等組織而發(fā)生轉(zhuǎn)移。顯然腫瘤轉(zhuǎn)移需要通過(guò)細(xì)胞與細(xì)胞間質(zhì)或與其他細(xì)胞的一系列相互作用而完成。

MMP-2是降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和基底膜主要結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵酶，與多種惡性腫瘤的發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)〔1，2〕。Li等〔3〕用免疫組化檢測(cè)了MMP-2蛋白在58例食管癌中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MMP-2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)與食管癌浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移階段呈正相關(guān)。本研究結(jié)果與Qi等〔4〕的研究結(jié)果相同，提示MMP-2參與食管癌的發(fā)生，作為食管癌發(fā)生的早期事件。本研究還發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞向深層侵襲和以后的轉(zhuǎn)移與其分泌的MMP-2有關(guān)，MMP-2是食管癌侵襲和轉(zhuǎn)移的一種促進(jìn)因素。

Smad4基因是一種抑癌基因，其蛋白產(chǎn)物Smad4蛋白為傳導(dǎo)TGF-β信號(hào)通路中一個(gè)關(guān)鍵的細(xì)胞內(nèi)信使，將TGF-β信號(hào)從細(xì)胞膜傳至細(xì)胞核。Smad4基因突變和缺失導(dǎo)致Smad4蛋白的異常表達(dá)，與胰腺癌〔5〕、直腸癌〔6〕胃癌〔7〕、肝癌〔8〕等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，與Smad4表達(dá)陰性者比較，Smad4表達(dá)陽(yáng)性者腫瘤分化較好，生長(zhǎng)速度較慢，侵襲和轉(zhuǎn)移能力弱，預(yù)后較好。本研究與車(chē)啟芬〔9〕、李昊等〔10〕的研究結(jié)果相同，提示Smad4蛋白表達(dá)缺失可能導(dǎo)致TGF-β信號(hào)途徑的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)的減弱或喪失并產(chǎn)生抗凋亡作用，從而具有選擇性生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，導(dǎo)致食管癌發(fā)生。Smad4蛋白在臨床分期ⅡB+Ⅲ期和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管癌組織中的表達(dá)陽(yáng)性明顯低于臨床分期Ⅰ+ⅡA期和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管癌組織。食管癌組織中Smad4的表達(dá)缺失與腫瘤的浸潤(rùn)深度密切相關(guān)與Fukuchi等〔11〕報(bào)道一致。以上的結(jié)果說(shuō)明，Smad4蛋白的表達(dá)缺失在食管癌的發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移中具有重要作用。

在惡性腫瘤發(fā)生機(jī)制的癌基因研究中，許多學(xué)者提出了基因協(xié)同作用假說(shuō)，認(rèn)為在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移的各階段，至少有兩個(gè)或兩個(gè)以上功能不同的異常激活的基因各自發(fā)揮不同的作用，并在時(shí)間和空間上相互配合，協(xié)同細(xì)胞的癌變。本研究發(fā)現(xiàn)，MMP-2在食管癌組織中表達(dá)量明顯高于癌旁不典型增生組織，同時(shí)Smad4蛋白在食管癌組織中表達(dá)量也明顯低于癌旁不典型增生組織;Smad4蛋白表達(dá)量與MMP-2表達(dá)量在食管癌的浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等方面呈顯著負(fù)相關(guān)，表明Smad4蛋白與MMP-2在食管癌的系列病理過(guò)程(如癌的發(fā)生、侵襲及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)中，具有負(fù)調(diào)節(jié)的協(xié)同作用的可能。這可能是Smads基因突變或功能失活，導(dǎo)致TGF-β信號(hào)途徑傳導(dǎo)中斷，產(chǎn)生的過(guò)多TGF-β作用于腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、MMP-2和MMP-9，負(fù)調(diào)控金屬蛋白酶抑制因子，從而為蛋白酶提供豐富的微環(huán)境，有利于腫瘤細(xì)胞的遷移和浸潤(rùn)適當(dāng)?shù)难苌掀ぜ?xì)胞，直接或間接地縱容了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

1 Xiao CH，F(xiàn)eng YM，Li XQ，et al.Clinical significance and relationship of expression of matrix metalloproteinase-2 mRNA with breast cancer metastasis〔J〕.Zhonghua Wai Ke Za Zhi，2005;43(9):599-604.

2 Li BH，Zhao P，Liu SZ，et al.Matrix metalloproteinase-2 and tissue inhibitor of metallo-proteinase-2 in colorectal carcinoma invasion and metastasis〔J〕.World J Gastroenterol，2005;11(20):3046-50.

3 Li Y，Ma J，Guo Q，et al.Overexpression of MMP-2 and MMP-9 in esophageal squamous cell carcinoma〔J〕.Dis Esophagus，2009;22(8):664-7.

4 Qi M，Li JS，Li Y，et al.Clinicopathological significance of expressions of RECK and MMP-2 in esophageal squamous carcinoma〔J〕.Zhonghua Zhong Liu Za Zhi，2010;32(4):283-5.

5 Zhao S，Venkatasubbarao K，Lazor JW，et al.Inhibition of STAT3 Tyr705 phosphorylation by Smad4 suppresses transforming growth factor beta-mediated invasion and metastasis in pancreatic cancer cells〔J〕.Cancer Res，2008;68(11):4221-8.

6 Wang H，Rajan S，Liu G，et al.Transforming growth factor beta suppresses beta-catenin/Wnt signaling and stimulates an adhesion response in human colon carcinoma cells in a Smad4/DPC4 independent manner〔J〕.Cancer Lett，2008;264(2):281-7.

7 Barros R，Pereira B，Duluc I，et al.Key elements of the BMP/SMADpathway co-localize with CDX2 in intestinal metaplasia and regulate CDX2 expression in human gastric cell lines〔J〕.J Pathol，2008;5(4):411-20.

8 Huang S，Zhang F，Miao L，et al.Lentiviral-mediated Smad4 RNAi induced anti-proliferation by p16 up-regulation and apoptosis by caspase 3 down-regulation in hepatoma SMMC-7721 cells［J］.Oncol Rep，2008;20(5):1053-9.

9 車(chē)啟芬，宋 陽(yáng)，葉冬梅，等.Smad4在人食管癌中的表達(dá)〔J〕.解剖科學(xué)進(jìn)展，2009;15(1):74-76.

10 李 昊，詹鶴琴，張洪福，等.SELIL和Smad4D蛋白表達(dá)與食管癌生物學(xué)行為的相關(guān)性研究〔J〕.臨床消化病雜志，2007;19(3):157-62.

11 Fukuchi M，Nakajima M，Miyazaki T，et al.Lack of activated Smad2 in transforming growth factor-beta signaling is an unfavorable prognostic factor in patients with esophageal squamous cell carcinoma〔J〕.J Surg Oncol，2006;94(1):51-6.