張婧雯 蔣軍廣 翟展藝 田 蕊 劉瑞芬 楊 超 孫 曼 史 江

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 河南省呼吸疾病研究所 河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450052)

多項(xiàng)研究表明，肺癌的發(fā)生、發(fā)展不僅與原癌基因的激活、抑癌基因的失活導(dǎo)致細(xì)胞增生過度和分化異常有關(guān)，還與細(xì)胞凋亡異常有關(guān)。人程序化死亡因子5(PDCD5)是凋亡促進(jìn)基因，國內(nèi)外文獻(xiàn)對PDCD5在NSCLC中表達(dá)的意義及其與細(xì)胞凋亡的關(guān)系報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)擬探討凋亡相關(guān)基因PDCD5在NSCLC中的表達(dá)情況及臨床生物學(xué)意義。

1 對象與方法

1.1 標(biāo)本 2008年1月至2009年11月在我院胸外科手術(shù)切除且病理證實(shí)為NSCLC的肺癌組織標(biāo)本60例，男性35例，女性25例，年齡30～78歲，平均54歲。鱗癌22例，腺癌38例，按組織學(xué)分級:高分化10例、中分化30例、低分化20例;按照2002年美國聯(lián)合癌癥分類委員會(huì)和國際抗癌聯(lián)盟制定的TNM分期標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ期17例、Ⅱ期19例、Ⅲ期18例、Ⅳ期6例;伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例，不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例;病理學(xué)或影像學(xué)檢查有胸膜轉(zhuǎn)移26例，無轉(zhuǎn)移34例。所有入選的肺癌病人術(shù)前均未接受任何抗腫瘤治療。取20例NSCLC癌旁正常肺組織(距腫瘤邊緣大于3 cm并經(jīng)病理切片證實(shí)為正常肺組織)作為對照。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 TUNEL凋亡試劑盒購于美國Promega公司，POD轉(zhuǎn)換劑購自美國羅氏公司，鼠抗人PDCD5單克隆抗體購于北京寶賽生物技術(shù)有限公司，S-P免疫組化試劑盒及DAB顯色劑均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 免疫組化染色 采用S-P法，主要步驟如下:石蠟切片脫蠟水化，于檸檬酸緩沖液中行微波抗原修復(fù)，過氧化物酶阻斷劑雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，非免疫性動(dòng)物血清封閉山羊血清阻斷非特異性反應(yīng)，滴加一抗鼠抗人PDCD5單克隆抗體，滴加生物素標(biāo)記的二抗，滴加鏈親和素-過氧化物酶制劑，DAB顯色后自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，稀鹽酸分化，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。

1.2.3 細(xì)胞凋亡的檢測 采用TUNEL法，主要步驟如下:石蠟切片脫蠟水化，4%多聚甲醛固定，1∶500蛋白酶K工作液通透組織切片，4%多聚甲醛后固定，Buffer液平衡切片，加入孵育緩沖液標(biāo)記DNA斷裂鏈，載玻片浸入2倍SSC液終止反應(yīng)，熒光顯微鏡下分析樣品，加入POD轉(zhuǎn)換劑轉(zhuǎn)換，DAB顯色后自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，稀鹽酸分化，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。

1.2.4 PDCD5陽性結(jié)果判定 在20×10高倍視野下，隨機(jī)選取5個(gè)有陽性細(xì)胞存在的視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，共500個(gè)細(xì)胞。PDCD5以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒計(jì)為陽性細(xì)胞。判定方法:(1)按陽性細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)評分:0分:0%，1分:＜10%，2分:10% ～50%，3分:＞50%。(2)按細(xì)胞染色深淺評分:無棕黃色顆粒，與背景無區(qū)別為0分;有棕黃色顆粒，明顯高于背景底色為1分;有染色較清晰的棕黃色顆粒，介于強(qiáng)弱之間為2分;有大量的深棕色顆粒，染色強(qiáng)為3分。綜合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)進(jìn)行判定，即 (1)+(2):最后得分≥4分為為陽性表達(dá)(+)，＜4分為陰性表達(dá) (－)。

1.2.5 凋亡細(xì)胞的陽性結(jié)果判定及凋亡指數(shù)(AI)的計(jì)算用TUNEL法對凋亡細(xì)胞進(jìn)行檢測，所測得的凋亡細(xì)胞為細(xì)胞核染成棕黃色的細(xì)胞。在40×10高倍視野下隨機(jī)選取10個(gè)視野觀察，計(jì)算凋亡細(xì)胞與所計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)的比值，即AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，χ2檢驗(yàn)的連續(xù)性校正及直線相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 PDCD5在正常肺組織和NSCLC組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系 60例NSCLC組織中PDCD5的陽性表達(dá)率為25.0%(15/60)，20例正常肺組織的陽性表達(dá)率為70.0%(14/20)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.144，P=0.000)。PDCD5陽性表達(dá)率與NSCLC分化、及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(均P＜0.05);與NSCLC患者的年齡、性別、腫瘤直徑、病理分型、是否吸煙及有無胸膜轉(zhuǎn)移無關(guān)。見表1。

表1 PDCD5在NSCLC組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系〔n(%)〕

2.2 PDCD5與細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系 PDCD5分值0分、1～2分、3～4分、5～6分者 AI分別為:1.64±0.77、1.90±0.83、3.23±1.50、4.05±1.55。PDCD5積分與 AI呈正相關(guān)(r=0.663，P=0.000)。

3 討論

PDCD5是一種新的程序性細(xì)胞死亡調(diào)控基因，由北京大學(xué)人類疾病基因研究中心馬大龍等〔1〕首次克隆。PDCD5在組織中表達(dá)廣泛，進(jìn)化保守，具有促進(jìn)凋亡的作用。研究表明，PDCD5在人類多種組織中表達(dá)(造血系統(tǒng)除外)，其表達(dá)有明顯的組織特異性，在成年心臟、睪丸、腎臟、腎上腺、胎盤中顯著表達(dá)，在各個(gè)胚胎組織中的表達(dá)明顯下降。PDCD5定位于染色體19q12-q1311，由125個(gè)氨基酸組成，包含6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子。PDCD5全長約6 kb，cDNA全長559 bp，包括polyA和AATAA加尾信號〔1〕。PDCD5在肝癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、肺癌等腫瘤中的表達(dá)明顯降低，而在自身免疫性疾病及退行性疾病中表達(dá)增加。迄今為止，PDCD5促凋亡的機(jī)制尚不很清楚。目前的研究傾向于:(1)作為caspase-3的正調(diào)控分子參與細(xì)胞凋亡，即通過結(jié)合活化的caspase-3，延長活化的caspase-3的體外半衰期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔1〕。(2)損傷線粒體，加速細(xì)胞凋亡，即通過線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔的開放及細(xì)胞色素C的釋放，引起膜電位降低〔2〕。本實(shí)驗(yàn)與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致〔3〕，提示 PDCD5的異常表達(dá)可能在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展中起到一定作用，PDCD5有望成為新的腫瘤標(biāo)記物。

PDCD5在NSCLC高分化組織中陽性表達(dá)率高于中、低分化組織，與閻紅娥等〔3〕報(bào)道的結(jié)果一致，提示PDCD5有助于分化程度的分級，PDCD5陽性表達(dá)率越低，NSCLC惡性程度越高。有文獻(xiàn)報(bào)道〔3，4〕PDCD5在NSCLC組織中的表達(dá)與臨床分期有關(guān)，隨著臨床分期的上升表達(dá)逐漸減弱。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示檢測PDCD5有助于TNM分期。TNM分期作為一種臨床分期的標(biāo)準(zhǔn)，對腫瘤預(yù)后的判斷有相當(dāng)重要的價(jià)值，TNM分期愈晚，預(yù)示著腫瘤侵襲性愈高和預(yù)后不良，因此檢測PDCD5可能有助于NSCLC預(yù)后的判斷。本研究還發(fā)現(xiàn)PDCD5的表達(dá)與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與孫曉坤等〔5〕在結(jié)腸癌中的研究結(jié)果一致，提示檢測PDCD5有助于有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的判斷。

本實(shí)驗(yàn)通過TUNEL法測得的PDCD5積分與AI呈正相關(guān)，因此推論P(yáng)DCD5在組織中的高表達(dá)促進(jìn)了突變的、多余的細(xì)胞發(fā)生凋亡，抑制了腫瘤的生長。但PDCD5能否成為診斷NSCLC的腫瘤標(biāo)記物及判斷其預(yù)后的有效指標(biāo)，還有待于更多的研究去證實(shí)。

1 馬大龍.新細(xì)胞因子及細(xì)胞凋亡基因的發(fā)現(xiàn)與功能研究〔J〕.北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2002;34(5):488-92.

2 田輝凱，夏 天，蔣春筍，等.TFAR19促進(jìn)小數(shù)線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔的開放〔J〕.生物化學(xué)和生物物理學(xué)報(bào)，2002;34(3):279-84.

3 閻紅娥，畢勝傳，孫云暉.人程序化死亡因子5(PDCD5)在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中的表達(dá)及相關(guān)性研究〔J〕.黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2009;32(1):20-1.

4 張雪梅，劉啟明，霍榮昌.PDCD5與Caspase-3在人非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)〔J〕.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2010;18(8):1533-6.

5 孫曉坤.凋亡相關(guān)基因PDCD5、Survivin在結(jié)腸癌組織的表達(dá)及臨床意義〔D〕.吉林大學(xué)，2008.