劉瑞芬 蔣軍廣 張曉燕 楊 超 孫 曼 史 江

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 河南省呼吸疾病研究所 河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450052)

肺癌是當(dāng)前發(fā)病率和死亡率極高的惡性腫瘤之一。研究表明，細(xì)胞凋亡在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。但哪些基因、蛋白與肺癌細(xì)胞凋亡及預(yù)后密切相關(guān)尚需進(jìn)一步研究。bax基因?yàn)閎cl-2基因家族中的重要一員，多與bcl-2形成二聚體共同調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。本文主要研究bax在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中的表達(dá)及與細(xì)胞凋亡的關(guān)系，以期為NSCLC的早期診斷、治療和評估預(yù)后提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 對象 隨機(jī)選取鄭大一附院病理科2009～2011年外科切除的NSCLC標(biāo)本60例，年齡36～87歲，所有病人在術(shù)前均未接受化、放療，病理診斷明確。其中男40例，女20例;鱗癌30例，腺癌30例;高分化15例，中、低分化45例;按照美國聯(lián)合癌癥分類委員會和國際抗癌聯(lián)盟制定的標(biāo)準(zhǔn)，TNM分期Ⅰ期和Ⅱ期共39例，Ⅲ期和Ⅳ期共21例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者27例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者33例;有胸腔積液者11例，無胸腔積液者49例。另設(shè)20例對照組，為癌旁正常組織(經(jīng)病理證實(shí))，所有標(biāo)本均為蠟塊包埋，由專業(yè)人員切片，每例3片。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 兔抗-Caspase-3(Active)、兔抗-bax均購于北京博奧森生物技術(shù)公司;凋亡試劑盒購于美國羅氏公司;SP9000試劑盒、DAB試劑盒，購自北京中杉生物工程公司。

1.2.2 免疫組化染色 將隨機(jī)所選的60例肺癌組織及20例正常對照組織交由病理科切片，切完后隨即放入60℃烤箱內(nèi)烘烤3小時，切片脫蠟至水，將切片放入裝有抗原修復(fù)液的缸子中，放入微波爐高溫5 min，低溫10 min后取出進(jìn)行抗原修復(fù)，過氧化物酶阻斷劑阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性;非免疫性動物血清阻斷非特異性反應(yīng);滴加一抗;加生物素標(biāo)記的二抗;滴加辣根酶標(biāo)記卵霉鏈白素;DAB顯色;蘇木素復(fù)染;梯度酒精脫水;中性樹膠封片。

1.2.3 細(xì)胞凋亡的檢測 將切片脫蠟至水，滴加蛋白酶K，滴加TUNEL反應(yīng)混合液，滴加POD轉(zhuǎn)換劑，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，中性樹膠封片。

1.2.4 bax陽性結(jié)果判定 bax染色為細(xì)胞質(zhì)或(和)細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒，定位準(zhǔn)確且無背景染色，分三步:(1)判定顏色，觀察所有片子的染色，無染色，也就是與背景染色無明顯差別為0分;淺染色為細(xì)胞質(zhì)或(和)細(xì)胞膜染為淺棕黃色，與背景顏色有差別，為1分;染為棕黃色，介于1與3分之間，為2分;染為深棕黃色，與背景顏色差別顯著為3分。(2)看染色細(xì)胞比例，高倍鏡(400倍)下每個視野計數(shù)100個細(xì)胞，每張切片計數(shù)5個視野，計算陽性細(xì)胞數(shù)占總癌癥細(xì)胞的百分比。0%為0分，0% ～10%為1分，10% ～50%為2分，＞50%為3分。(3)兩者所得數(shù)值相加的分值結(jié)果為總分值，總分值＜4為陰性，≥4為陽性。

1.2.5 凋亡細(xì)胞的陽性結(jié)果判定及凋亡指數(shù)(AI)的計算凋亡細(xì)胞經(jīng)TUNEL法處理后，細(xì)胞核被染為棕黃色，使用光學(xué)顯微鏡，計數(shù)每1 000個腫瘤細(xì)胞中凋亡細(xì)胞個數(shù)。需排除有嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)和壞死灶的區(qū)域，以免造成假陽性。AI為計數(shù)每1 000個腫瘤細(xì)胞中凋亡細(xì)胞所占的比例。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS17.0軟件包處理。采用配對四格表的χ2檢驗(yàn)及直線相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC組織中bax的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系 肺癌組織60例中bax陽性31例(48.3%)，癌旁正常組織20例中bax陽性12例(60%)，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.419，P=0.517)，但癌組織的染色均要深于正常組織。結(jié)果顯示，高分化組織的陽性表達(dá)率高于中低分化，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者陽性率較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者低，TNM分期Ⅰ期和Ⅱ期陽性率高于Ⅲ、Ⅳ期陽性率(均P＜0.05)。Bax的表達(dá)與年齡、性別、病理分型、是否合并胸腔積液、腫瘤直徑、是否吸煙、腫瘤生長在左肺還是右肺無明顯關(guān)系(P＞0.05)。見表1。

表1 NSCLC中bax的表達(dá)及于臨床病理特征的關(guān)系〔n(%)〕

2.2 bax與細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系 bax分值0、1～2、3～4、5～6分的各組 AI分別為 3.57±0.55、5.44±1.41、8.05±1.40、10.05±1.62，相關(guān)性分析顯示bax積分與AI呈正相關(guān)(r=0.855，P=0.000)。

3 討論

近年來，凋亡異常在腫瘤的發(fā)生中所起的作用越來越受重視。凋亡過程的紊亂與腫瘤產(chǎn)生關(guān)系密切，它受多種基因的調(diào)控，包括凋亡促進(jìn)基因、凋亡抑制基因，各種凋亡效應(yīng)基因共同作用〔1～3〕。bax基因?yàn)榈蛲龃龠M(jìn)基因。近年來，大量學(xué)者對bax、bcl-2聯(lián)合研究，并認(rèn)為兩者的比值與腫瘤發(fā)展關(guān)系密切。bax存在于人體各個組織，研究表明它與肝癌、胃癌、骨肉瘤、血管瘤、腦損傷〔4～8〕的發(fā)生都有密切關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示bax在肺癌組織與癌旁正常組織中表達(dá)無明顯差異，與魏衛(wèi)等〔9〕的結(jié)論一致。但辛彩霞等〔10，11〕研究結(jié)論認(rèn)為bax在肺癌組織中的表達(dá)要高于癌旁正常組織，另有學(xué)者〔12，13〕認(rèn)為bax在肺癌組織中的表達(dá)要低于癌旁正常組織、產(chǎn)生分歧的原因可能為:①實(shí)驗(yàn)樣本量較小造成的誤差;②凋亡不足是腫瘤發(fā)生的原因，但腫瘤往往存在過度增殖，也可能存在大量凋亡，只是增殖的速度大于凋亡，這還需要大量的研究去證實(shí)。大量研究〔12，13〕認(rèn)為bax蛋白在NSCLC中的表達(dá)低于正常肺組織，在高、中分化患者中的表達(dá)高于低分化者。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與王鴻程等〔14〕的研究結(jié)果一致，提示bax表達(dá)下調(diào)可能與腫瘤的惡性程度有關(guān)，對其進(jìn)行檢測有可能提示NSCLC患者的腫瘤惡性程度及判斷預(yù)后;者陽性率(33.3%)較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(66.7%)低，本研究結(jié)果還提示bax表達(dá)下調(diào)在腫瘤的早期轉(zhuǎn)移有一定關(guān)系，bax表達(dá)下調(diào)的患者預(yù)后不好，與文獻(xiàn)〔15〕報道一致。bax表達(dá)與凋亡呈正相關(guān)，提示bax基因下調(diào)或缺失導(dǎo)致凋亡減少，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

bax基因的表達(dá)與NSCLC的臨床分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但bax基因能否成為診斷NSCLC的腫瘤標(biāo)記物及判斷其預(yù)后的有效指標(biāo)，還有待于更多的研究去證實(shí)。

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