阮美穎，葉青靜，王榮青，姚祝平，周國(guó)治，萬紅建，楊悅儉

(1．浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004;2．浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

番茄 (Solanum lycopersicumMill．)在蔬菜中占有舉足輕重的地位，全國(guó)番茄年種植面積66.7萬hm2，產(chǎn)值400億元。但番茄業(yè)的發(fā)展受諸多不利因素的制約。目前，番茄黃化曲葉病毒病(TYLCVD)是制約番茄生產(chǎn)的不利因素之一，這種病害分布廣泛，危害重，造成產(chǎn)量銳減。防治番茄黃化曲葉病毒病最為有效的途徑是培育優(yōu)良的抗病品種。

浙粉702為浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院新育成的抗番茄黃化曲葉病毒病的番茄品種，長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，成熟果粉紅色，商品性好，抗病性強(qiáng)，抗番茄黃化曲葉病毒病、葉霉病和枯萎病等，深受種植者青睞，推廣應(yīng)用面積不斷增加，制種量也增加。但在制種過程中，常因機(jī)械混雜、去雄不徹底或者去雄不及時(shí)等原因，會(huì)發(fā)生種子混雜或者假雜種現(xiàn)象，種子純度受影響。種子純度的降低會(huì)明顯降低品種的產(chǎn)量和品質(zhì)，因此，種子純度鑒定是浙粉702推廣的重要保障。分子標(biāo)記技術(shù)可快速鑒定番茄種子的純度，1998年欒雨時(shí)等［1］利用 RAPD技術(shù)鑒定番茄種子純度。本研究旨在利用CAPS和SSR分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建番茄品種浙粉702及其親本的DNA指紋圖譜，探索適合室內(nèi)使用的番茄雜種純度快速鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 材料

浙粉702、父本Z3及母本7969F2-19由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供。TaqDNA聚合酶、dNTP、KpnI、XbaI、ScaI、Hin6I 及SmaI 為TAKARA公司產(chǎn)品，HindIII、TaqI和EcoRI為上海生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，HinfI、RsaI和Hpy188I為NEB公司產(chǎn)品，引物由上海生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 基因組DNA快速提取

浙粉702、Z3及7969F2-19基因組總 DNA的提取參照周國(guó)治等［2］方法。

1.3 引物

從 http://solgenomics．net/獲得 SSR、CAPS和RFLP標(biāo)記，并對(duì)RFLP標(biāo)記cLET-1-I13、cLEG-31-P16、T0693和TG590的核苷酸序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物序列并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 PCR反應(yīng)及電泳

PCR反應(yīng)體系。20～80 ng DNA模板，上游引物與下 游引物各 0.25 μmmol· L－1，0.2 mmol·L－1dNTPs，2 mmol·L－1Mg2+，1 × 反應(yīng)緩沖液，1UTaq酶，加水補(bǔ)足至總體積為20 μL。

PCR反應(yīng)條件。94℃ 3 min;94℃ 50 s，53℃ 50 s，72℃ 50 s，循環(huán) 35次;72℃延伸10 min。

電泳檢測(cè)。提取的番茄基因組DNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。將SSR引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物10 μL與1 μL上樣緩沖液混勻，經(jīng)8%

CAPS酶切。TaqI限制性內(nèi)切酶在65℃下酶切5 h，其他內(nèi)切酶在37℃酶切5 h。酶切后的PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其多態(tài)性。

1.5 DNA指紋圖譜的構(gòu)建與驗(yàn)證

對(duì)浙粉702、Z3及7969F2-19的基因組 DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出互補(bǔ)差異條帶，構(gòu)建浙粉702的DNA指紋圖譜。在浙粉702種子中混合Z3和7969F2-19的種子，定向驗(yàn)證浙粉702 DNA指紋圖譜。在浙粉702種子中摻入浙雜203、浙砧204、浙粉209、浙粉208、浙雜301和809的種子，進(jìn)行盲樣檢測(cè)和真?zhèn)悟?yàn)證。

1.6 浙粉702種子純度鑒定

用建立的浙粉702DNA指紋圖譜對(duì)來源不同地區(qū)、不同制種戶及不同批次的浙粉702進(jìn)行純度鑒定，并與田間形態(tài)、抗性等鑒定結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄品種基因組DNA的提取

采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量，結(jié)果 (圖1)顯示，采用CTAB法提取番茄試驗(yàn)樣品 (父母本及雜交種)的DNA，為1條清晰完整的DNA帶，沒有降解，所提DNA質(zhì)量較高。

2.2 SSR和CAPS標(biāo)記的篩選

PCR反應(yīng)體系中主要成分對(duì)擴(kuò)增結(jié)果影響較大，因此，在篩選標(biāo)記前，對(duì)PCR反應(yīng)體系中模板濃度、引物濃度、TaqDNA聚合酶濃度、dNTP濃度、Mg2+離子濃度以及循環(huán)次數(shù)、退火溫度等因素進(jìn)行了研究，從而建立優(yōu)化的番茄PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系。

圖1 采用CTAB法提取番茄樣品的DNA電泳結(jié)果

通過來自 http://solgenomics．net/網(wǎng)站標(biāo)記的篩選，經(jīng)過多次重復(fù)和比較，最終確定帶型清晰、穩(wěn)定性好的13個(gè)SSR標(biāo)記和17個(gè)CAPS標(biāo)記作為鑒定浙粉702番茄品種的標(biāo)記。多數(shù)SSR引物對(duì)樣品擴(kuò)增出2條以上的條帶，片段的大小為50～500 bp(圖2);多數(shù) CAPS標(biāo)記的 PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后有2條以上的條帶，片段的大小為50～2 000 bp(圖 3)。在篩選引物的過程中，發(fā)現(xiàn)雜交種與雙親之間的帶型有以下幾種類型:雜交種與雙親帶型相同;雜交種出現(xiàn)偏父本型條帶;雜交種出現(xiàn)偏母本型條帶;一親本為強(qiáng)帶，另一親本無帶，雜交種介于中間的所謂中間型雙親均為弱帶而雜交種為強(qiáng)帶的增強(qiáng)型;雜交種比雙親多條帶少條帶類型;雜交種與雙親有互補(bǔ)帶型。這幾種類型中，用于雜交種純度鑒定最理想的帶型是互補(bǔ)帶型，這種帶型能將雜交種與雙親明確區(qū)分開。篩選出的 SSR標(biāo)記 SOL3194F3/R4、SOL3194F2/R2、TGS2216F4/R4、C2_At3g56230F/R、CAPS標(biāo)記C2_ At3g56040F1/R4、 C2_ At3g56040F2/R3、cLEG-31-P16F3/R2、cLET-1-113F1/R1可以將浙粉702、父本Z3及母本7969F2-19完全區(qū)分開，父母本與雜交種具有互補(bǔ)帶型 (圖2)。

圖2 番茄SSR標(biāo)記的篩選結(jié)果

圖3 番茄CAPS標(biāo)記的篩選結(jié)果

2.3 定向?qū)嶒?yàn)檢測(cè)種子純度

在浙粉702種子中摻入親本種子進(jìn)行盲樣檢測(cè)，結(jié)果 (圖4)與實(shí)際情況相符，4和7是父本，12是母本，1，2，3，5，6，8，9，10，11是浙粉702，表明建立的指紋圖譜能有效檢測(cè)出親本。

2.4 種子真?zhèn)舞b定

圖4 利用引物TGS2216F4/R4和C2_At3g56040F1/R4鑒定浙粉702及其親本

圖5 用TGS2216F4/R4和C2_At3g56040F1/R4鑒定浙粉702種子的真?zhèn)?/p>

用構(gòu)建的指紋圖譜對(duì)浙粉702番茄品種進(jìn)行種子真?zhèn)舞b定，結(jié)果 (圖5)表明，用TGS2216F4/R4和C2_At3g56040F1/R4構(gòu)建的浙粉702的指紋圖譜能較好的區(qū)分浙粉702和其他番茄品種。1，2，3，7，8，10是浙粉 702，4是浙雜 203，5是浙砧204，6是浙粉209，9是浙粉208，11是浙雜301，12是809。

2.5 浙粉702種子純度鑒定

用構(gòu)建的浙粉702指紋圖譜鑒定不同制種戶的浙粉702生產(chǎn)種。抽取2批，每批隨機(jī)檢測(cè)100個(gè)雜交種。第1批檢測(cè)出2個(gè)混雜的種子，種子純度為99%，第2批種子純度為100%，表明浙粉702生產(chǎn)種達(dá)到了國(guó)家規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。

3 小結(jié)和討論

長(zhǎng)期以來，種子生產(chǎn)者、經(jīng)營(yíng)者、使用者和管理者期盼著對(duì)品種真實(shí)性和純度鑒定有快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的室內(nèi)檢測(cè)方法。隨著DNA指紋技術(shù)的迅速發(fā)展，為快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確鑒定品種真實(shí)性和純度提供了技術(shù)支撐。在多種分子標(biāo)記技術(shù)中，RAPD-PCR技術(shù)由于費(fèi)用低、分析快、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，適合構(gòu)建特定品種的指紋圖譜，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于小麥［3］、大麥［4］、玉米［5］及水稻［6］等作物種子純度鑒定。但是RAPD-PCR的多態(tài)性不太高，并且穩(wěn)定性和重復(fù)性較差，而CAPS和SSR技術(shù)，呈共顯性遺傳，易于分析，穩(wěn)定性和重復(fù)性較好，具有信息含量高等特點(diǎn)，適合雜交種品種純度的鑒定。

由于國(guó)內(nèi)用于番茄育種的親本材料遺傳變異幅度小，所以很多國(guó)內(nèi)的番茄品種不易找到多態(tài)性的差異。篩選出能夠區(qū)分雙親和雜交種的CAPS和SSR引物是很重要的。目前，開展番茄品種純度鑒定工作，首先要利用好現(xiàn)有的番茄CAPS和SSR標(biāo)記，再自主開發(fā)更多的CAPS和SSR標(biāo)記。

本研究以浙粉702、父本Z3及母本7969F2-19為試驗(yàn)材料，篩選出了能夠區(qū)分浙粉702、Z3及7969F2-19的CAPS和SSR標(biāo)記，建立了適合于檢測(cè)番茄種子純度的反應(yīng)體系，從而為CAPS和SSR技術(shù)在番茄種子純度鑒定中的應(yīng)用和推廣打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

［1］欒雨時(shí)，蘇喬，李海濤，等．利用RAPD技術(shù)快速鑒定番茄雜種純度 ［J］．園藝學(xué)報(bào)，1998，25(3):247－251．

［2］Williamson VM，Ho J Y，Wu F F，et al．A PCR-based marker tightly linked to the nematode resistance gene，Mi，in tomato［J］．Theoretical and Applied Genetics，1994，87:757－763．

［3］向太和，汪秀峰，李莉，等．利用RAPD標(biāo)記對(duì)我國(guó)主栽的秈優(yōu)雜交稻和其親本進(jìn)行區(qū)別和鑒定 ［J］．作物學(xué)報(bào)，2000，26(3):292－296．

［4］雷開榮，林清，郝風(fēng)，等．鮮食玉米渝糯7號(hào)DNA指紋圖譜建立及應(yīng)用研究 ［J］．玉米科學(xué)，2006，14(1):43－45．

［5］McDonald M B，Elliot L J，Sweeney P M．DNA extraction form dry seeds for RAPD analysis in varietal identification studies［J］．Seed Science and Technology，1994，22:171－176．

［6］Tinker N A，F(xiàn)ortin M G，Mather D E．Random amplified polymorphic DNA and pedigree relationship in spring barley［J］．Theor AppI Genet，1993，85:976 －984．