楊 琳 王慧君 吳柏林 黃國(guó)英 周文浩 郭曉紅

人類基因組計(jì)劃( HGP) 耗資30 億美元，用了約10 年，完成了人類個(gè)體全基因組測(cè)序工作。隨之而來(lái)的人類基因組單倍型圖計(jì)劃、個(gè)體基因組計(jì)劃，再到千元基因組計(jì)劃，基因組時(shí)代高調(diào)而來(lái)。傳統(tǒng)的Sanger 測(cè)序技術(shù)［1］已不能滿足大規(guī)模核酸測(cè)序的需求，第二代測(cè)序技術(shù)( Next generation sequencing，NGS) 最主要的特征是高通量，快速、低成本［2～4］。NGS 通過(guò)反復(fù)測(cè)序同一區(qū)域的DNA 片段，達(dá)到很高的靈敏度和準(zhǔn)確度，同時(shí)自動(dòng)化程度高，能在很短的時(shí)間內(nèi)完成對(duì)上百億堿基的測(cè)序，為基因組分析提供了新的手段。

NGS 由于其技術(shù)操作、數(shù)據(jù)質(zhì)量和數(shù)據(jù)分析等方面的問(wèn)題，尚未廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)。本研究采用Ion Torrent PGMTM平臺(tái)，基于PCR 擴(kuò)增的文庫(kù)構(gòu)建方法，選取在兒科臨床較為常見(jiàn)的單基因遺傳性疾病，對(duì)其致病基因同時(shí)進(jìn)行直接Sanger 測(cè)序和NGS 檢測(cè)，對(duì)其結(jié)果進(jìn)行比較分析，旨在對(duì)NGS 在臨床檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行初步探索。

1 方法

1.1 對(duì)象 復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院( 我院) 臨床診斷為肌營(yíng)養(yǎng)不良癥( DMD，2 例) 、膽汁酸合成障礙(1 例) 和甲基丙二酸血癥(1 例) 的病例。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患兒家屬簽署知情同意書。

1.2 NGS 方法

1.2.1 外周血DNA 提取 外周靜脈血經(jīng)EDTA 抗凝，使用全血試劑盒提取DNA( Qiagen Inc.，Germantown，MD) 。使用NanoDrop ND-1000 分光光度計(jì)檢測(cè)DNA 濃度及吸光度值，電泳檢測(cè)DNA 降解程度。

1.2.2 PCR 擴(kuò)增 DMD 基因( NM_004006.2，13 993 bp)引物為美國(guó)波士頓兒童醫(yī)院吳柏林教授惠贈(zèng)。HSD3B7 基因( NM _ 025193. 3，2 203 bp) 、AMACR 基 因( NM _001167595.1，2 603 bp) 和MUT 基因( NM_000255.3，3 886 bp) 采用Primer3( v. 0. 4. 0) 進(jìn)行在線引物設(shè)計(jì)。使用KAPA2G Robust HotStart ReadMix 進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。最終反應(yīng)體系為25 μL，其中DNA 模板20 ng，正反向引物各1.0 μL( 濃 度 為10 μmol·L-1) ，PCR Mix 12. 5μL。采 用Touchdown PCR，參數(shù)為95℃3 min，其后14 個(gè)循環(huán)為95℃20 s、64℃20 s( 每個(gè)循環(huán)降低0.5℃) 、72℃30 s，其后25個(gè)循環(huán)為95℃20 s、57℃20 s、72℃30 s，最終72℃延長(zhǎng)5 min。5 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖電泳，以判斷特異性擴(kuò)增結(jié)果。

1.2. 3 PCR 產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)化 PCR 產(chǎn)物采用Sequal Prep Normalization kit ( catalog A10510-01；Invitrogen) 試劑盒進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，其后將單個(gè)樣本的全部PCR 產(chǎn)物混合，標(biāo)準(zhǔn)化過(guò)程可以保證每個(gè)PCR 產(chǎn)物以等量混合。

1.2.4 Ion Torrent 文庫(kù)構(gòu)建 PCR 產(chǎn)物混合后，采用Ion Shear( catalog no.4471248；Life Technologies) 進(jìn)行PCR 產(chǎn)物酶切打斷；采用Ion Xpress Plus Fragment Library Kit( catalog no.4471269； Life Technologies) 連接 街 頭； 采 用Ion Xpress Barcode Adapters 1-16 Kit ( catalog no. 4471250； Life Technologies) 分別加標(biāo)簽，標(biāo)簽1 ～4 分別對(duì)應(yīng)病例1 ～4。采用E-Gel 選擇大小在200 bp 的片段； 采用Ion Library Quantitation Kit( catalog no.4468802； Life Technologies) 進(jìn)行qPCR 方法的文庫(kù)定量。

1. 2. 5 乳液PCR 和ISPs 富集 采用Ion template preparation kit ( catalog no. 4469000； Life Technologies) 和One Touch( Life Technologies) 進(jìn)行乳液PCR( emulsion PCR，emPCR) ；采用Ion Xpress template kit、MyOne streptavidin C1 beads( catalog no. 4469001、650. 01； Life Technologies) 進(jìn)行ISPs 富集。

1.2.6 Ion Torrent PGM 平臺(tái)的序列檢測(cè) 采用Ion PGM Sequencing kit( catalog no.4462923； Life Technologies) 及Ion Torrent 314 芯片( catalog no.4462923；Life Technologies) ，進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。共65 個(gè)測(cè)序循環(huán)，使用18 歐姆純化水、標(biāo)準(zhǔn)壓縮氬氣驅(qū)動(dòng)PGM 內(nèi)液體的流動(dòng)。

1.2.7 結(jié)果分析 采用Ion torrent PGMTM服務(wù)器自帶分析軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果初步分析，得到整體數(shù)據(jù)量、平均測(cè)序深度和參考序列匹配程度等數(shù)據(jù)。其后生成FASTA 文件，采用NextGENe 軟件( DEMO v2.3.0) 進(jìn)行后續(xù)的序列數(shù)據(jù)結(jié)果分析，參考序列為NextGENe 軟件自帶的人類基因組序列( Human Genome 37.2) 。

1.2.8 MLPA 及Sanger 驗(yàn)證結(jié)果 針對(duì)基因序列檢測(cè)，采用如前所述引物，使用KAPA2GTMRobust HotStart ReadMix進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)體系及條件與前述相同。PCR 產(chǎn)物采用Applied Biosystems 3500xl 基因分析儀進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果采用MutationSurveyor( v 4.0.7 Demo) 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對(duì)于DMD 基因缺失/重復(fù)的檢測(cè)采用MRC Holland 公司商業(yè)化試劑盒( SALSA P034、P035) ，采用MLPA 技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 NGS 初步結(jié)果 如圖1 所示，芯片中有效區(qū)域達(dá)78.7%，其中連接有文庫(kù)的為96%。除去20%的多克隆，13%的低質(zhì)量文庫(kù)和12%測(cè)試片段，最終有效的文庫(kù)為67.1%，共578 830 個(gè)讀取片段。片段平均讀長(zhǎng)為108 bp，最長(zhǎng)讀長(zhǎng)187 bp。產(chǎn)生的原始測(cè)序數(shù)據(jù)總量為62.8 Mb，其中達(dá)到Q20( 與參考序列99%匹配) 為54.99 Mb。選用了人類基因組( GRCh37，hg19) 上述基因的序列為參考序列( http: //www.ncbi. nlm. nih. gov/gene) 。結(jié)果發(fā)現(xiàn)總計(jì)有55.8 Mb 與參考序列匹配，占總序列數(shù)的90%。其中以DMD 基因參考序列編碼區(qū)比對(duì)的結(jié)果，平均測(cè)序深度為511.3 ×，AQ20 的平均測(cè)序深度為276.8 ×。

圖1 Ion Torrent PGMTM服務(wù)器產(chǎn)生的測(cè)序的初步分析結(jié)果Fig 1 Preliminary results of sequencing by Ion Torrent PGMTM

2.2 NGS 突變檢測(cè)結(jié)果( 表1) 例1: 檢測(cè)到DMD 基因編碼區(qū)一個(gè)已知致病突變: c.998C ＞A，p.333S ＞X； 4 個(gè)SNP ( http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/projects/SNP/) :rs228406( c.2645A ＞G，p.882D ＞G) ； rs1801187( c.5234G＞A，p. 1745R ＞H) ； rs1801188( c. 7728T ＞C，p. 2576N ＞N) ；rs1800280( c.8810G ＞A，p.2937R ＞Q) 。1 個(gè)意義不明變異:c.10127insT，F(xiàn)S。例2:檢測(cè)到DMD 基因5 個(gè)外顯子的缺失( g.2788933943-2790543577) ，為DMD 常見(jiàn)的致病缺失區(qū)段。例3:檢測(cè)到HSD3B7 基因編碼區(qū)2 個(gè)復(fù)合雜合突變:c.45-46delAG，F(xiàn)S； c.262G ＞G/C ，p. 88G ＞RG，第1個(gè)為已知致病突變位點(diǎn)，第2 個(gè)為未報(bào)道的位點(diǎn)。1 個(gè)SNP:rs9938550( c.748A ＞G，p. 250T ＞A) 。檢測(cè)到AMACR基因4 個(gè)SNP: rs3195676 ( c. 25G ＞GA，p. 9V ＞VM) ；rs10941112( c. 524G ＞GA，p. 175G ＞GD) ； rs2278008( c.829G ＞GA，p. 277E ＞EK) ； rs2287939( c. 602T ＞TC，p.201L ＞LS) 。例4: 檢測(cè)到MUT 基因編碼區(qū)1 個(gè)已知致病突變位點(diǎn): c.728-729het-insTT，F(xiàn)S；3 個(gè)SNP: rs2229384( c.636G ＞G/A，p. 212K ＞K) ；rs8589( c.2011A ＞A/G，p. 671I＞V) ；rs1141321( c.1595C ＞CT，p. 532R ＞RH) 。1 個(gè)意義不明變異:c.1540G ＞GT，p.514Q ＞KQ。

2.3 MLPA 及Sanger 檢測(cè)結(jié)果 例1: 采用Sanger 測(cè)序方 法，檢測(cè)到DMD 基因編碼區(qū)5 個(gè)變異，分別為c.2645A ＞G、c.5234G ＞A、c.7728T ＞C、c.8810G ＞A、c.998C ＞A，均與Ion Torrent 測(cè)序結(jié)果相符合。Ion Torrent 檢測(cè)到的c.10127insT 改變，Sanger 測(cè)序未發(fā)現(xiàn)。例2: MLPA 驗(yàn)證了Ion Torrent 檢測(cè)到的缺失。例3: HSD3B7 基因檢測(cè)到3 個(gè)變異: c.45-46delAG、c.262G ＞G/C、c.748A ＞G，均與Ion Torrent 測(cè)序結(jié)果相符合。AMACR 基因檢測(cè)到4 個(gè)SNP，分別為c.25G ＞GA、c.524G ＞GA、c.829G ＞GA、c.602T ＞TC，均與Ion Torrent PMG 測(cè)序結(jié)果相一致。例4:MUT 基因檢測(cè)到3 個(gè)變異:c.728-729het-insTT、c.636G ＞G/A、c.2011A＞A/G，與Ion Torrent 測(cè)序結(jié)果相符合。Ion Torrent 檢測(cè)到的c.1595C ＞CT、c.1540G ＞GT 改變，Sanger 測(cè)序未發(fā)現(xiàn)。

圖2 Ion Torrent PGMTM檢測(cè)結(jié)果Fig 2 Results of Ion Torrent PGMTM detection

3 討論

Ion Torrent PGMTM平臺(tái)的NGS 檢測(cè)，通過(guò)目的基因PCR 擴(kuò)增、文庫(kù)構(gòu)建、乳液PCR 和測(cè)序流程，得到檢測(cè)結(jié)果僅需2 ～3 d。且以目的基因組合為基礎(chǔ)的后期數(shù)據(jù)處理，直觀和快捷。Ion 314 芯片為例，如本文獲得的總數(shù)據(jù)量為62.8 Mb，以DMD 基因?yàn)槔渚幋a區(qū)及UTR 區(qū)域全長(zhǎng)平均測(cè)序深度為200 倍計(jì)算，每張314 芯片可以同時(shí)完成4 ～5 個(gè)樣本的檢測(cè)，每例樣本的費(fèi)用低于第一代Sanger 直接測(cè)序，與此同時(shí)，該技術(shù)所需投入的人力及耗時(shí)又有大幅度的降低，適合于臨床較大規(guī)模的檢測(cè)使用。

本文對(duì)4 例遺傳學(xué)疾病患兒的相對(duì)應(yīng)的4 個(gè)致病基因進(jìn)行檢測(cè)。Ion Torrent PGMTM平臺(tái)共檢測(cè)到18 個(gè)變異，15個(gè)在Sanger 直接測(cè)序中也檢測(cè)到，即包括突變也包括SNP，即包含純合變異也包含雜合變異，突變類型中包含插入、缺失和置換，說(shuō)明該檢測(cè)方法的敏感性較好。但I(xiàn)on Torrent PGMTM平臺(tái)檢測(cè)到3 個(gè)假陽(yáng)性，回顧原始圖像，發(fā)現(xiàn)1 個(gè)為在6 個(gè)連續(xù)的T 后面提示插入了一個(gè)T。此類問(wèn)題是NGS數(shù)據(jù)處理、分析過(guò)程中遇到的較為共性的問(wèn)題。從原理上講，Ion Torrent PGMTM平臺(tái)根據(jù)電壓變化的幅度來(lái)判斷連續(xù)相同堿基的個(gè)數(shù)方面仍存在一定的問(wèn)題，這需要數(shù)據(jù)處理分析的不斷完善來(lái)加以避免。目前，已經(jīng)可以通過(guò)軟件對(duì)此類假陽(yáng)性進(jìn)行過(guò)濾。另外2 個(gè)假陽(yáng)性發(fā)生在MUT 基因的檢測(cè)中，均提示為堿基置換，考慮可能為測(cè)序深度不足造成的結(jié)果不準(zhǔn)確，同時(shí)將部分G 和C 錯(cuò)讀成了T，提示雜合變異，對(duì)于此類數(shù)據(jù)在今后臨床應(yīng)用中應(yīng)予以高度注意。這類假陽(yáng)性可以通過(guò)提高測(cè)序覆蓋倍數(shù)進(jìn)行鑒別。

本研究檢測(cè)的DMD 基因突變所導(dǎo)致的DMD，是人類常見(jiàn)的X 連鎖隱性遺傳性疾病，國(guó)外報(bào)道DMD 的發(fā)病率為1/ 3 917 ～1/4 700 活 產(chǎn) 男 嬰［5，6］。DMD 基 因 位 于Xp21.1-21.3，長(zhǎng)度為2.4 Mb，是人類最大的基因之一。在DMD 基因突變類型中單一或多個(gè)外顯子的缺失占60% ～70%［7，8］，單一或多個(gè)外顯子的重復(fù)占5% ～10%［8～10］，序列改變( 點(diǎn)突變、小的插入或缺失、剪接異常) 在男性患者中占25% ～35%［8，11～13］。既往由于DMD 基因過(guò)大導(dǎo)致的直接測(cè)序時(shí)間、費(fèi)用消耗巨大，許多實(shí)驗(yàn)室也在尋找其他突變篩查方法，包括變性高效液相色譜分析、內(nèi)引物單一條件擴(kuò)增技術(shù)［14，15］和高分辨率熔解曲線分析［16］，但隨著直接測(cè)序費(fèi)用的降低，上述方法已少有使用。目前，多采用傳統(tǒng)PCR 及Sanger 直接測(cè)序方法，但其主要不足是人力及時(shí)間消耗大，效率低。針對(duì)于DMD 基因的微重復(fù)/微缺失的檢測(cè)，以往有多重PCR( mPCR)［17］、Southern 印跡［18］和FISH探針?lè)?。mPCR 只能覆蓋不足1/4 的外顯子；體系復(fù)雜，條件不易穩(wěn)定，優(yōu)化困難；通過(guò)用cDNA 探針的Southern 印跡需要1 ～2 周時(shí)間用來(lái)分析，使用放射性同位素作為示蹤物，并需要較多的DNA。近年來(lái)逐漸被發(fā)展起來(lái)的MLPA［19］和染色體微陣列芯片( CMA) 技術(shù)［20，21］所取代，但也受到成本、時(shí)間的限制，且不能同時(shí)針對(duì)序列改變進(jìn)行檢測(cè)。而NGS 技術(shù)的誕生及發(fā)展，由于其高通量、高敏感性的優(yōu)點(diǎn)，針對(duì)于基因序列改變、男性X 連鎖的致病基因部分缺失的檢測(cè)，能彌補(bǔ)目前現(xiàn)有技術(shù)的不足，為臨床檢測(cè)提供新的方法。本文例1 為DMD 基因的點(diǎn)突變所導(dǎo)致，例2是DMD 基因5 個(gè)外顯子的缺失所導(dǎo)致，作為DMD 的兩種常見(jiàn)突變形式，都可被NGS 方法所檢測(cè)到。

HSD3B7 基因編碼3β 羥基δ5-C27 類固醇氧化還原酶，位于16p12-p11.2，含有6 個(gè)外顯子，DNA 全長(zhǎng)3 kb，該基因的純合或復(fù)合雜合突變可引起先天性膽汁酸合成障礙1 型( CBAS1)［22］。AMACR 基因編碼α 甲基酰輔酶A 消旋酶，定位于5p13.2，含有6 個(gè)外顯子，該基因突變亦可引起先天性膽汁酸合成障礙4 型( CBAS4)［23］。本文例3，男，3 個(gè)月25 d，主因“皮膚黃染3 個(gè)月”就診，患兒生后4 d 出現(xiàn)黃染，大便呈黃色糊狀；體檢發(fā)現(xiàn)皮膚、鞏膜中度黃染，肝肋下捫及4 cm；血生化提示高結(jié)合膽紅素血癥、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶及總膽汁酸正常、轉(zhuǎn)氨酶升高、凝血功能障礙； 腹部B 超提示肝臟腫大，雙側(cè)腎臟損害，臨床診斷為先天性膽汁酸合成障礙繼發(fā)腎臟結(jié)晶。膽汁酸合成障礙占兒童膽汁淤積性疾病的1% ～2%，是一種罕見(jiàn)的遺傳性疾病，多為常染色體隱性遺傳。本例檢測(cè)到HSD3B7 基因c.45-46delAG 和c.262G ＞G/C 的復(fù)合雜合突變，其中c.45-46delAG 為已報(bào)道的致病突變［24］，c.262G ＞G/C 為未報(bào)道的錯(cuò)義突變，導(dǎo)致第88 位氨基酸從甘氨酸變成精氨酸。結(jié)合對(duì)患兒父母的檢測(cè)結(jié)果，證實(shí)c.45-46delAG 來(lái)自患兒母親，c.262G ＞G/C來(lái)自患兒父親，診斷為CBAS1。

MUT 基因編碼甲基丙二酸輔酶A 異構(gòu)酶，該基因突變可引起甲基丙二酸血癥，MUT 位于6p12.3，含有13 個(gè)外顯子，DNA 全長(zhǎng)35 kb［25］。本文例4，男，6 歲，主因“意識(shí)不清9 d 伴語(yǔ)言障礙”就診，尿串聯(lián)質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)甲基丙二酸，3-羥基丁酸和乙酰乙酸顯著升高，臨床診斷為甲基丙二酸血癥。NGS 檢測(cè)到c.729-730het-insTT，已有研究報(bào)道該位點(diǎn)的純合突變可導(dǎo)致酶活性的完全喪失［26］，但該患兒的遺傳方式以及雜合突變是否可導(dǎo)致酶活性的部分喪失，有待進(jìn)一步對(duì)父母進(jìn)行檢測(cè)及功能學(xué)的研究加以證實(shí)。

從本研究的檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，Ion Torrent PGMTM在4 個(gè)基因中檢測(cè)到的15 個(gè)序列改變、1 個(gè)片斷缺失( 男性，X 染色體) ，與Sanger 直接測(cè)序結(jié)果完全一致，為NGS 技術(shù)應(yīng)用于臨床的可靠性提供了依據(jù)。但存在3 個(gè)假陽(yáng)性報(bào)告，提示其數(shù)據(jù)處理、分析仍有待改進(jìn)和完善。同時(shí)也強(qiáng)調(diào)了對(duì)于NGS 結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證的必要性。

綜上所述，二代測(cè)序Ion Torrent PGMTM平臺(tái)，采用PCR產(chǎn)物定量混合構(gòu)建文庫(kù)測(cè)序的方法，因其靈活可變、數(shù)據(jù)分析相對(duì)簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，比較適用于臨床常見(jiàn)遺傳性疾病的檢測(cè)。但由于其技術(shù)本身可能帶來(lái)的假陽(yáng)性問(wèn)題，仍需要技術(shù)層面、數(shù)據(jù)分析層面的共同完善來(lái)加以避免。

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