楊靖宇

肺癌是癌癥引發(fā)死亡的第一大原因，2008年在全球范圍內(nèi)大約造成1,380,000例死亡[1]。根據(jù)組織學(xué)分類，肺癌可分為非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌，其中前者占據(jù)肺癌的80%[2]。肺癌預(yù)后很差，目前化療仍然是晚期疾病治療的主要手段。鉑類藥物，包括順鉑和卡鉑，是此類疾病化療最常用的藥物，腫瘤細(xì)胞對鉑類藥物產(chǎn)生耐藥性是臨床治療失敗的主要原因[3]，克服耐藥性是提高臨床治療效果的迫切需要。鉑類藥物與DNA的堿基結(jié)合，干擾DNA合成，抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘發(fā)細(xì)胞凋亡。腫瘤細(xì)胞耐受鉑類藥物的機(jī)制主要為兩方面，一方面過表達(dá)多藥耐藥基因（multidrug resistance genes, MRG）以減少藥物在細(xì)胞內(nèi)的蓄積，另一方面提高腫瘤細(xì)胞抗凋亡能力。對這兩種機(jī)制涉及的信號通路做深入研究并尋找克服耐藥性的方法一直是癌癥研究的重點(diǎn)。已發(fā)現(xiàn)的機(jī)制包括Src激酶活性升高誘導(dǎo)MDR1和LRP過表達(dá)[4]，PI3K/Akt信號通路異?；钴S導(dǎo)致肺癌轉(zhuǎn)移和耐藥[5]。

PPAR-γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma）是一種II型核受體，在人類細(xì)胞中由PPARG基因編碼。PPAR-γ的基本功能包括調(diào)節(jié)脂肪酸的儲存和糖代謝，因此臨床上它與肥胖、糖尿病和動脈粥樣硬化等代謝疾病密切相關(guān)[6]。同時，PPAR-γ還與癌癥密切相關(guān)。臨床前研究[7]發(fā)現(xiàn)，配體激活PPAR-γ可控制腫瘤的生長，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。因此，PPARG被認(rèn)為是一個抑癌基因，靶向PPAR-γ是治療腫瘤的一個潛在有效的手段。然而，PPAR-γ與腫瘤耐藥的關(guān)系尚未得到充分的研究。本文對PPAR-γ沉默后A549順鉑耐藥性的變化進(jìn)行研究，并對其中的分子機(jī)制進(jìn)行初步的研究。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所；細(xì)胞培養(yǎng)基購自Gibco；PPAR-γ siRNA質(zhì)粒及對照siRNA質(zhì)粒均購自Santa Cruz生物技術(shù)公司；MTT試劑、RT-PCR試劑盒購自Promega公司；凋亡檢測試劑盒購自BD公司；順鉑購自Sigma公司；抗PPAR-γ、Akt、p-Akt、caspase-3、bcl-2和bax單抗購自Santa Cruz公司；ECL免疫印跡底物試劑盒購自Millipore；流式細(xì)胞儀：BD公司，酶標(biāo)儀：Thermo，PCR儀：Thermo。

1.2 細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng) A549培養(yǎng)于10 cm培養(yǎng)皿，37oC、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)基為90% F-12K，10%胎牛血清（FBS）。0.25%胰酶-EDTA消化傳代，所有試驗(yàn)均采用對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.3 PPAR-γ siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞并篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆 A549培養(yǎng)于6孔板中，按照試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。經(jīng)優(yōu)化，按照1 μg siRNA Plasmid：1 μL siRNA Plasmid Transfection Reagent的比例配制轉(zhuǎn)染試劑。當(dāng)細(xì)胞融合程度達(dá)到60%-70%時，用2 mL siRNA Transfection Medium洗滌細(xì)胞2次，每孔加入0.8 mL siRNA Transfection Medium和0.2 mL上述轉(zhuǎn)染試劑（含1 μg質(zhì)粒），繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，加入1 mL含20% FBS的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，吸走培養(yǎng)基，加入含有4 μg/mL嘌呤霉素的選擇培養(yǎng)基。在該濃度的嘌呤霉素下，未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在4天后即死亡。每隔3-4天更換選擇培養(yǎng)基，直至得到克隆生長的細(xì)胞。

1.4 MTT法檢測順鉑對細(xì)胞生長的作用 取對數(shù)生長期的A549以及克隆細(xì)胞，分別以4×104個/mL接種到96孔微孔板中，100 μL/孔，培養(yǎng)過夜使細(xì)胞貼壁。向?qū)?yīng)試驗(yàn)孔加入不同濃度的順鉑，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，吸去培養(yǎng)基，加入100 μL含0.5 mg/mL MTT的F-12K，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸去MTT，加入100 μL DMSO，使MTT結(jié)晶完全溶解，最后用酶標(biāo)儀測定490 nm波長下的OD值，并計(jì)算藥物對細(xì)胞的抑制率。抑制率＝（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值）×100%。以順鉑濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)作圖并擬合抑制曲線，50%抑制率所對應(yīng)的化合物濃度即為IC50值。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期的A549和A549/PPAR-γ(-)細(xì)胞，分別加入10 μmol/L順鉑，繼續(xù)于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，然后收集上清及貼壁的細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/mL，用凋亡檢測試劑盒染色，最后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞。該試劑盒通過Annexin V與外翻的磷脂酰絲氨酸結(jié)合，PI與細(xì)胞核結(jié)合，檢測凋亡細(xì)胞。

1.6 Western blot法檢測細(xì)胞PPAR-γ、p-Akt、caspase-3和bcl-2/bax的表達(dá) 取對數(shù)生長期的A549和A549/PPAR-γ(-)細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解提取蛋白。BCA法測定細(xì)胞裂解物的蛋白含量，取等量蛋白質(zhì)以12%SDS-PAGE法分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以相應(yīng)的單克隆抗體室溫孵育4 h以檢測目標(biāo)蛋白。洗去一抗，以HRP連接的二抗室溫孵育2 h，洗滌后以ECL試劑盒顯示免疫反應(yīng)條帶。β-actin作為內(nèi)參。

1.7 RT-PCR檢測細(xì)胞中PPARG和bcl-2基因的mRNA水平取對數(shù)生長期的A549和A549/PPAR-γ(-)細(xì)胞，用Trizol法提取各組總RNA，用Real-Time PCR試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。PPAR-γ上游引物序列：5'-ACTGTCGGTTTCA GAAGTGC-3'，下游引物序列：5'-ATGGACACCATACT TGAGC-3'；bcl-2上游引物序列：5′-ACGGGGTGAACTG GGGGAGGA-3′，下游引物序列：5′-TGTTTGGGGCAGG CATGTTGACTT-3′；以β-actin為內(nèi)參，上游引物序列：5'-TCCTGTGGCATCCACGAAACT-3'，下游引物序列：5'-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3'。94oC變性3 min后，按下述條件擴(kuò)增40個循環(huán)：95oC、5 s，65oC、35 s，72oC、60 s，循環(huán)后72oC延伸5 min。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以Mean±SD表示，使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析。采用單因素方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)行比較，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞克隆表達(dá)更低的PPAR-γ PPAR-γ siRNA質(zhì)粒或?qū)φ誷iRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞，在含有嘌呤霉素的選擇培養(yǎng)基中篩選并克隆化培養(yǎng)。只有成功轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的細(xì)胞方能在選擇培養(yǎng)基中生長。經(jīng)過克隆增殖后，收集克隆細(xì)胞以RT-PCR和Western blot檢測PPAR-γ的表達(dá)水平，驗(yàn)證siRNA沉默效果，最終確定克隆1組和克隆2組。兩個克隆間的沉默水平不同，命名為沉默組1和沉默組2（siRNA-1 group和siRNA-2 group），用于后續(xù)研究，如圖1所示，兩例克隆細(xì)胞的PPAR-γ蛋白表達(dá)量均明顯低于母細(xì)胞A549（control group）和空載體陰性對照組（negative group），沉默組PPAR-γ mRNA表達(dá)分別為母細(xì)胞組的42.6%±2.22%（P＜0.000,1）和28.5%±1.63%（P＜0.000,1），對照siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染克隆A549細(xì)胞的PPAR-γ表達(dá)水平保持不變。

2.2 PPAR-γ表達(dá)沉默提高細(xì)胞對順鉑的耐受性 以母系A(chǔ)549細(xì)胞，對照siRNA和PPAR-γ siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為研究對象，通過MTT法分別檢測細(xì)胞對順鉑的敏感性（圖2）。試驗(yàn)結(jié)果顯示，對照siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞對順鉑的敏感性，IC50為（11.4±0.82）μmol/L，母細(xì)胞A549為IC50為（12.3±0.78）μmol/L，相比未發(fā)生明顯變化，而PPAR-γ沉默后的細(xì)胞對順鉑的耐受性增加，表現(xiàn)為IC50值的升高，沉默組1的 IC50為（14.7±0.97）μmol/L，沉默組2的IC50為（18.2±1.08）μmol/L。

2.3 PPAR-γ表達(dá)沉默抑制細(xì)胞凋亡 為尋找PPAR-γ沉默后細(xì)胞對順鉑耐受性提高的原因，分析對比了順鉑處理后細(xì)胞凋亡的比例。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，在順鉑的作用下，A549的凋亡細(xì)胞明顯可見。母細(xì)胞組凋亡率為43.2%±2.42%，經(jīng)PPAR-γ沉默的沉默組1和組2其凋亡細(xì)胞比例分別為32.5%±1.73%（P=0.003,4）和25.1%±1.34%（P=0.000,3），明顯低于母細(xì)胞組（圖3），這一結(jié)果與MTT結(jié)果一致，說明細(xì)胞對順鉑耐受的提高與細(xì)胞抗凋亡能力的提高有關(guān)。

2.4 PPAR-γ表達(dá)沉默抑制細(xì)胞凋亡與Akt磷酸化、caspase-3和bcl-2/bax表達(dá)水平上調(diào)有關(guān) 為進(jìn)一步探索PPAR-γ調(diào)控細(xì)胞凋亡的機(jī)制，通過Western blot檢測細(xì)胞在順鉑處理后Akt磷酸化、caspase-3和bcl-2/bax表達(dá)水平。與母細(xì)胞相比，沉默組1和沉默組2細(xì)胞中Akt磷酸化水平和bcl-2/bax的表達(dá)水平明顯上升，caspase-3表達(dá)水平明顯下降（圖4）。

2.5 PPAR-γ對bcl-2表達(dá)的調(diào)控源自基因轉(zhuǎn)錄水平 RT-PCR分析顯示，相比對照細(xì)胞，A549/PPAR-γ(-)在順鉑處理后，bcl-2 mRNA水平明顯上調(diào)，分別為母細(xì)胞組的156.2%±11.23%（P＜0.000,1）和188.4%±13.46%（P＜0.000,1）（圖5），這一結(jié)果與Western blot的結(jié)果一致，說明PPAR-γ對bcl-2表達(dá)的調(diào)控是通過轉(zhuǎn)錄水平實(shí)現(xiàn)的。

圖 1 PPAR-γ沉默表達(dá)A549細(xì)胞系的構(gòu)建。#P＞0.05，*P＜0.05。Fig 1 The construction of stably PPAR-γ silencing expression A549 cell lines. The expression of PPAR-γ in A549 cell lines was measured by Western blot (A) and real time PCR (B). #P＞0.05, *P＜0.05.

3 討論

肺癌是全球癌癥的第一原因，也是癌癥的第一死因。鉑類藥物作為肺癌的一線化療藥物，在疾病的治療中表現(xiàn)出一定的效果，但隨著治療時間的推移，腫瘤往往產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致治療失敗。深入研究腫瘤對鉑類化療藥物產(chǎn)生耐藥的分子機(jī)制，并尋找新的可運(yùn)用于臨床的治療策略，是提高患者臨床受益的迫切需要。

腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐受性的最常見機(jī)制有兩種[8]，一種是過表達(dá)特定的多藥耐藥蛋白，如MDR1、MRP1等，這些蛋白具有跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的功能，可以消耗ATP的方式將藥物從細(xì)胞內(nèi)泵出細(xì)胞外，降低藥物在細(xì)胞內(nèi)蓄積和藥靶部位的有效濃度；另一種機(jī)制則是針對藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用特點(diǎn)，腫瘤細(xì)胞的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)發(fā)生一系列的變化，導(dǎo)致細(xì)胞抗凋亡能力提高，凋亡減少。

圖 2 PPAR-γ對A549細(xì)胞藥物敏感性的抑制作用Fig 2 Inhibition effect of PPAR-γ on A549 cells drug sensitivity

圖 3 PPAR-γ對A549細(xì)胞凋亡的抑制作用。#P＞0.05，*P＜0.05。Fig 3 Inhibition effect of PPAR-γ on A549 cells apoptosis. #P＞0.05, *P＜0.05.

圖 4 PPAR-γ對A549細(xì)胞凋亡相關(guān)基因蛋白表達(dá)的影響Fig 4 The effect of PPAR-γ on protein expression of apoptosis-relative gene in A549 cell lines

圖 5 PPAR-γ對A549細(xì)胞bcl-2 mRNA表達(dá)的影響。#P＞0.05，*P＜0.05。Fig 5 The effect of PPAR-γ on mRNA expression in A549 cell lines. β-actin was used as an internal. #P＞0.05, *P＜0.05.

PPAR-γ屬于PPARs家族的一員，該家族為核轉(zhuǎn)錄因子，在與相應(yīng)的配體結(jié)合后介導(dǎo)目標(biāo)基因的表達(dá)或者抑制[6]。PPAR-γ高表達(dá)于脂肪組織中，它是脂肪細(xì)胞分化的主要調(diào)控因子[9,10]。同時，PPAR-γ也表達(dá)于其它組織中，例如乳腺、結(jié)腸、肺、卵巢、前列腺和甲狀腺中[11]。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)PPAR-γ與癌癥存在特定關(guān)系。在乳腺癌中，PPAR-γ高表達(dá)的患者具有更好的無疾病生存期[12]。同樣地，PPAR-γ也表達(dá)于小細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌中[13]。在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中，配體誘導(dǎo)PPAR-γ活化可誘導(dǎo)細(xì)胞生長停滯，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化并誘導(dǎo)凋亡[14-16]。然而，PPAR-γ在腫瘤耐藥中的作用還沒有得到充分的研究。

根據(jù)其在腫瘤細(xì)胞中的作用，我們推測PPAR-γ的下調(diào)可能是腫瘤細(xì)胞耐藥的機(jī)制之一。因此，本研究中我們首先構(gòu)建了質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的可穩(wěn)定下調(diào)PPAR-γ的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549/PPAR-γ(-)，并通過RT-PCR和Western blot對構(gòu)建結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。隨后的MTT研究結(jié)果顯示，A549/PPAR-γ(-)對順鉑的耐受性增加，表現(xiàn)為IC50值升高，并且耐受性與PPAR-γ的表達(dá)量成負(fù)相關(guān)，即PPAR-γ表達(dá)越低，耐受性越高。為了進(jìn)一步地闡明PPAR-γ下調(diào)后賦予A549細(xì)胞耐藥性的分子機(jī)制，根據(jù)已知的PPAR-γ在腫瘤細(xì)胞中可能發(fā)揮的作用，我們利用流式細(xì)胞術(shù)檢測了腫瘤細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞對順鉑的耐受性提高與凋亡減少密切相關(guān)。PPAR-γ作為一個轉(zhuǎn)錄因子，本身無法直接對細(xì)胞凋亡產(chǎn)生影響，必須通過調(diào)控與凋亡相關(guān)的蛋白表達(dá)方能發(fā)揮作用。Bcl-2和caspase-3是一個在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用的蛋白，在很多腫瘤中發(fā)現(xiàn)二者的表達(dá)與腫瘤的耐藥密切相關(guān)[17,18]。本研究發(fā)現(xiàn)，在A549/PPAR-γ(-)細(xì)胞中，bcl-2的蛋白表達(dá)水平明顯升高，caspase-3表達(dá)明顯下降，PPAR-γ表達(dá)下降致使bcl-2升高和caspase-3上調(diào)是腫瘤產(chǎn)生耐藥的主要機(jī)制之一。進(jìn)一步的RT-PCR證實(shí)，bcl-2的表達(dá)升高是通過bcl-2基因轉(zhuǎn)錄水平升高實(shí)現(xiàn)的，這與PPAR-γ作為轉(zhuǎn)錄因子的作用特點(diǎn)吻合。另外一個與腫瘤耐藥密切相關(guān)的信號通路是PI3K/Akt[5,19]。Western blot研究顯示，A549/PPAR-γ(-)細(xì)胞中Akt的磷酸化水平升高，說明在該細(xì)胞中，PI3K/Akt的活化也參與到細(xì)胞對順鉑的耐藥中，但PPAR-γ如何與PI3K/Akt進(jìn)行對話尚不清楚，值得深入研究。上述這些調(diào)控均體現(xiàn)出與PPAR-γ表達(dá)量相關(guān)的效應(yīng)關(guān)系。

總之，本研究顯示沉默PPAR-γ可使A549細(xì)胞對順鉑的耐受性提高，其機(jī)制是通過上調(diào)bcl-2表達(dá)、增強(qiáng)PI3K/Akt信號通路，進(jìn)而使得細(xì)胞抗藥物誘導(dǎo)凋亡的能力增強(qiáng)。因此，PPAR-γ表達(dá)的下降很可能是臨床腫瘤產(chǎn)生耐藥的一種重要甚至是普遍的機(jī)制。同時，本研究不排除PPAR-γ還可能通過bcl-2和PI3K/Akt以外的途徑增加腫瘤細(xì)胞的耐藥性，值得進(jìn)一步的研究。