崔永奇 耿沁 顧愛琴 朱淼鑫 孔韓衛(wèi) 孫磊 劉蕾 閆明霞 姚明

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和致死率最高的惡性疾病之一，大約90%的肺癌患者死于轉(zhuǎn)移[1,2]，而骨轉(zhuǎn)移占晚期肺癌的50%-70%[3]，這將進(jìn)一步引起高血鈣癥、神經(jīng)壓迫、殘疾、病理性骨折等癥狀，導(dǎo)致患者生活質(zhì)量的迅速下降[4]。但是，目前在治療肺癌骨轉(zhuǎn)移方面我們?nèi)〉玫某晒€很少，尚且沒有一種完全有效的方法來預(yù)防和治療骨轉(zhuǎn)移。由于肺癌骨轉(zhuǎn)移灶的形成是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜的生物學(xué)過程[5]，因此，一個(gè)合適的可以用來了解和探討肺癌骨轉(zhuǎn)移機(jī)制的小動(dòng)物模型的建立就顯得尤為重要，這對于以后探索出新的肺癌骨轉(zhuǎn)移臨床預(yù)防和治療方案具有深遠(yuǎn)的意義。

由于在肺癌的幾種病理類型中腺癌的骨轉(zhuǎn)移率最高[6]，因此本實(shí)驗(yàn)我們以幾種肺腺癌細(xì)胞系為基礎(chǔ)進(jìn)行肺癌骨轉(zhuǎn)移裸小鼠模型的建立，希望能為以后進(jìn)行肺癌骨轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 本實(shí)驗(yàn)使用了四種肺腺癌細(xì)胞系：A549、NCI-H1299（以下簡稱H1299）、SPC-A-1、XL-2。其中A549、H1299由ATCC提供，SPC-A-1由上海市胸科醫(yī)院提供，XL-2[7]是我們實(shí)驗(yàn)室從發(fā)生全身轉(zhuǎn)移的肺腺癌病人的腹水中分離并建系。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級BLAB/c-nu/nu裸小鼠50只，雌雄兼用，6 w-8 w鼠齡，體重20 g-22 g，由上海市腫瘤研究所提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號為SCXK (滬) 2012-0001；所有小鼠均在無特殊病原體 (specific pathogen free, SPF) 級環(huán)境中飼養(yǎng)，飼料和水自由攝入，使用許可證號為SYXK(滬) 2012-0001。

1.1.3 主要試劑、耗材 胎牛血清FBS（Biowest, South America Origin），4%多聚甲醛固定液和EDTA脫鈣液(上海威奧生物科技有限公司）、Transwell小室（8 μm pore size, Corning, USA）、Matrigel Matrix（BD Bioscience,USA）

1.1.4 儀器設(shè)備 微計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)（micro computed tomography, MicroCT）（skyscan1076，比利時(shí)）、全自動(dòng)病理分析系統(tǒng)（Leica，德國）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) A549、H1299、SPC-A-1、XL-2四種細(xì)胞系培養(yǎng)條件為DMEM培養(yǎng)基，內(nèi)含10%胎牛血清和青霉素（100 U/mL）及鏈霉素（100 mg/mL），細(xì)胞培養(yǎng)條件為37oC、5%CO2。

1.2.2 細(xì)胞增殖能力 四種細(xì)胞均取2,000個(gè)加入到96孔板各孔內(nèi)，每天各種細(xì)胞均取3個(gè)孔，每孔加CCK8（Dojindo, Japan）、DMEM混合液110 μL，2 h后檢測450 nm波長處吸光度以計(jì)算每孔內(nèi)活細(xì)胞的數(shù)目。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.3 細(xì)胞體外侵襲、遷移能力 將凍存于-20 °C Matrigel膠放于4 °C過夜，使其由凝固狀態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)；用DMEM將其稀釋到1 mg/mL，并迅速加入到Transwell上室內(nèi)膜上、鋪平，每個(gè)小室40 μL，37 °C孵育2 h。用DMEM懸浮細(xì)胞，濃度調(diào)整至1×105/0.2 mL，接種于各上室，在各下室加入800 μL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，37 °C培養(yǎng)箱中孵育，18 h后取出小室，棄去培養(yǎng)基，用棉簽拭去內(nèi)表面未侵襲細(xì)胞；將各個(gè)Transwell放入100%甲醇中室溫固定30 min，棄去各個(gè)上室內(nèi)甲醇后，再將其放入0.1%結(jié)晶紫中染色30 min，然后PBS洗2遍，棉簽將小室內(nèi)表面擦拭干凈，倒置顯微鏡下拍照，計(jì)數(shù)遷移到小室外表面的細(xì)胞數(shù)目，取平均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)與侵襲實(shí)驗(yàn)不同之處：上室不需加入DMEM稀釋的Matrigel膠，細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/0.2 mL，孵育時(shí)間為12 h左右。

1.2.4 模型建立

1.2.4.1 實(shí)驗(yàn)分組 將50只裸小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，其中一組為對照組，每只左心室注射0.2 mL生理鹽水，另外四組為實(shí)驗(yàn)組，每只左心室注射0.2 mL相應(yīng)四種肺腺癌細(xì)胞懸液，分別命名為A549實(shí)驗(yàn)組、H1299實(shí)驗(yàn)組、SPC-A-1實(shí)驗(yàn)組、XL-2實(shí)驗(yàn)組。

1.2.4.2 左心室注射 將以上四種細(xì)胞于細(xì)胞對數(shù)生長期消化下來，加入不含血清的DMEM培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/0.2 mL，將小鼠仰臥固定在固定板上，用1%戊巴比妥鈉按照每克小鼠體重0.01 mL的劑量進(jìn)行腹腔注射麻醉，酒精棉球常規(guī)消毒小鼠前胸壁，1 mL胰島素注射器（29 G, BD Bioscience）抽吸0.2 mL細(xì)胞懸液于胸骨左旁3 mm第二肋間、與胸廓成45度夾角，對準(zhǔn)正中進(jìn)針，一般進(jìn)針6 mm，當(dāng)針尖頭有自動(dòng)持續(xù)的鮮紅色動(dòng)脈血不斷搏動(dòng)地進(jìn)入針芯即表明真尖已進(jìn)入左心室。對照組小鼠用同樣的方法進(jìn)行注射，每只僅注射0.2 mL生理鹽水。術(shù)后繼續(xù)在SPF環(huán)境中飼養(yǎng)，并密切觀察小鼠狀態(tài)。

1.2.5 MicroCT掃描 觀察小鼠狀態(tài)，自左心室注射術(shù)后第2周起定期對各組小鼠運(yùn)用MicroCT進(jìn)行掃描（條件為40 KV，250 mA，分辨率35 μm），以確定是否已發(fā)生肺癌骨轉(zhuǎn)移以及骨轉(zhuǎn)移部位，并進(jìn)行拍照，三維重建。

1.2.6 組織病理學(xué)鑒定 以小鼠出現(xiàn)明顯消瘦為這組實(shí)驗(yàn)結(jié)束點(diǎn)。選取實(shí)驗(yàn)組及對照組小鼠中軸骨（如：肋骨、脊柱、髂骨、肩胛骨）、四肢長骨等部位骨組織，將其截成0.5 cm×0.3 cm×0.2 cm大小骨片，生理鹽水清洗后立即投入冷凍的4%多聚甲醛固定液中，4 °C固定12 h-24 h；固定結(jié)束后骨片在0.2 mol磷酸緩沖液中充分漂洗。漂洗結(jié)束后投入EDTA脫鈣液中，室溫下脫鈣，脫鈣液每4天-5天更換一次新液，經(jīng)過3次更換新液后，此后每天更換新液，直至骨片完全脫鈣為止，每日檢查脫鈣情況，以大頭針能刺進(jìn)骨密質(zhì)為完成脫鈣標(biāo)準(zhǔn)。脫鈣結(jié)束后，骨片用蒸餾水沖洗20 min，然后進(jìn)行常規(guī)脫水處理、石蠟包埋、切片（切片厚度4.5 μm），行蘇木素-伊紅染色。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用Mean±SD表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)或單因素方差分析，P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 四種細(xì)胞體外增殖能力分析 如圖1所示。

2.2 四種細(xì)胞之間體外侵襲、遷移能力比較 Transwell結(jié)果顯示四種細(xì)胞體外無論是侵襲能力還是遷移能力均按A549、H1299、SPC-A-1、XL-2的順序由高到低排列，具體結(jié)果如圖2所示。

2.3 模型建立

2.3.1 模型建立情況 5組小鼠左心室注射后全部成活。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，對照組小鼠生長狀況良好，無明顯消瘦、活動(dòng)障礙等情況；實(shí)驗(yàn)組小鼠每組術(shù)后均有一定概率的消瘦，脊柱彎曲、肋骨、肩胛骨、下頜骨、髂骨、四肢長骨等不同部位的骨轉(zhuǎn)移現(xiàn)象發(fā)生，每組小鼠骨轉(zhuǎn)移率及具體骨轉(zhuǎn)移部位見表1、表2。

2.3.2 MicroCT結(jié)果 對照組小鼠MicroCT顯示骨密度均勻，未見骨質(zhì)缺損、骨折現(xiàn)象發(fā)生；實(shí)驗(yàn)組小鼠每組內(nèi)均可見脊柱、肩胛骨、下頜骨、四肢長骨等不同部位低密度病灶，骨皮質(zhì)缺損、骨組織破壞嚴(yán)重（圖3）。

2.3.3 組織病理學(xué)結(jié)果 對照組小鼠骨組織切片正常，未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶；每個(gè)實(shí)驗(yàn)組小鼠骨組織切片經(jīng)HE染色發(fā)現(xiàn)有肩胛骨、股脛骨、肋骨、脊柱等不同部位的腫瘤轉(zhuǎn)移灶：骨髓腔內(nèi)成片的腫瘤細(xì)胞排列紊亂、細(xì)胞分化差、核大濃染，骨組織結(jié)構(gòu)消失，如圖4所示。

2.4 骨轉(zhuǎn)移分析

2.4.1 四個(gè)實(shí)驗(yàn)組骨轉(zhuǎn)移結(jié)果 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)每個(gè)實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的小鼠數(shù)目、出現(xiàn)轉(zhuǎn)移癥狀所用時(shí)間如表1所示。

圖1 體外生長曲線檢測四種細(xì)胞之間群體細(xì)胞增殖能力。*P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Fig 1 In vitro cell growth curve assay of four cell lines. *P＜0.05,there was statistical significance among the proliferation ability of the four cell lines.

圖2 體外侵襲、遷移實(shí)驗(yàn)檢測四種肺腺癌細(xì)胞系之間侵襲、遷移能力的差異。A：四種肺腺癌細(xì)胞之間遷移實(shí)驗(yàn)（×100）；B：四種肺腺癌細(xì)胞之間侵襲實(shí)驗(yàn)（×100）；*P＜0.05，四種細(xì)胞之間侵襲、遷移能力差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Fig 2 In vitro invasion and migration assays of 4 lung adenocarcinoma lines. A: The migration ability of 4 lung adenocarcinoma lines using the migration assay (×100); B: The invasion ability of the 4 lung adenocarcinoma lines using the matrigel invasion assay (×100); *P＜0.05, there was statistical significance.

圖3 對照組及各實(shí)驗(yàn)組小鼠MicroCT。A1-D1：對照組小鼠正常脊柱、肋骨、脛骨、肩胛骨MicroCT結(jié)果；A2：A549實(shí)驗(yàn)組內(nèi)出現(xiàn)的脊柱轉(zhuǎn)移；B2：H1299實(shí)驗(yàn)組內(nèi)出現(xiàn)的肋骨轉(zhuǎn)移；C2：SPC-A-1實(shí)驗(yàn)組內(nèi)出現(xiàn)的脛骨破壞；D2：XL-2實(shí)驗(yàn)組內(nèi)出現(xiàn)的肩胛骨變化；箭頭所示處為各部位的骨質(zhì)破壞。Fig 3 MicroCT of the mice in the assay. A1-D1: MicroCT of the mice in the control group show the normal spinal column, rib, tibia and scapula;A2: MicroCT of the mice in the A549 experimental group shows the spinal column metastasis; B2: MicroCT of the mice in the H1299 experimental group shows rib metastasis; C2: MicroCT of the mice in the SPC-A-1 experimental group indicates tibia metastasis; D2: MicroCT of the mice in the XL-2 experimental group indicates scapula metastasis; Arrows show different bone metastatic sites of lung cancer.

圖4 實(shí)驗(yàn)組及對照組小鼠骨切片HE染色。A1：對照組小鼠正常脊柱；A2：A549實(shí)驗(yàn)組小鼠脊柱發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的情況；B1：對照組小鼠正常肋骨；B2：H1299實(shí)驗(yàn)組小鼠肋骨處腫瘤轉(zhuǎn)移情況；C1：對照組小鼠正常脛骨；C2：SPC-A-1實(shí)驗(yàn)組腫瘤脛骨轉(zhuǎn)移；D1：對照組小鼠正常肩胛骨；D2：XL-2實(shí)驗(yàn)組小鼠發(fā)生腫瘤肩胛骨轉(zhuǎn)移。Fig 4 HE staining was performed to confirm the bone lesion in the control group and experimental groups. A1: The normal spinal column in the control group; A2: Spinal column with tumor metastasis in the A549 experimental group; B1: Normal rib in the control group; B2: Rib with tumor metastasis in the H1299 experimental group; C1: Normal tibia in the control group; C2: Tibia with tumor metastasis in the SPC-A-1 experimental group; D1: Normal scapula in the control group; D2: Scapula with tumor metastasis in the XL-2 experimental group; T: Tumor, B: Bone.

表1 四個(gè)實(shí)驗(yàn)組每組小鼠出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移所用平均時(shí)間及每組骨轉(zhuǎn)移概率Tab 1 The average time cost and the bone metastatic rate of each experimental group

表2 各實(shí)驗(yàn)組骨轉(zhuǎn)移部位分析Tab 2 Analysis on the bone metastatic sites of the experimental groups

2.4.2 轉(zhuǎn)移部位分析 至實(shí)驗(yàn)結(jié)束A549實(shí)驗(yàn)組、H1299實(shí)驗(yàn)組、SPC-A-1實(shí)驗(yàn)組、XL-2實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移的小鼠總數(shù)依次為 6只、4只、5只、4只，對每個(gè)實(shí)驗(yàn)組內(nèi)出現(xiàn)的骨轉(zhuǎn)移按照中軸骨、四肢長骨進(jìn)行歸類，具體結(jié)果如表2。

3 討論

目前對于骨轉(zhuǎn)移模型建立的研究比較多的集中于乳腺癌[8,9]及前列腺癌[10]，而對于肺癌骨轉(zhuǎn)移模型建立的報(bào)道還比較有限，腺癌作為肺癌中骨轉(zhuǎn)移率最高的一種病理類型，對其骨轉(zhuǎn)移機(jī)制的探索越來越引起人們的重視。針對這一特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過大量預(yù)實(shí)驗(yàn)的探索，最終通過左心室注射的方法獲得了經(jīng)影像學(xué)、組織病理均證實(shí)發(fā)生了骨轉(zhuǎn)移的肺腺癌裸小鼠模型。臨床上肺癌骨轉(zhuǎn)移的部位通常首先累及中軸骨，其次為股骨、肱骨等四肢長骨，本實(shí)驗(yàn)中四個(gè)實(shí)驗(yàn)組內(nèi)每組出現(xiàn)中軸骨轉(zhuǎn)移的概率均明顯高于四肢長骨，這與Coleman等[11,12]研究的結(jié)論一致，肺腺癌骨轉(zhuǎn)移裸小鼠模型建立成功。

左心室注射法是目前使用較廣泛的一種腫瘤轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型制作方法[13]，有很多優(yōu)點(diǎn)，并且能驗(yàn)證“種子與土壤”學(xué)說[14]：腫瘤細(xì)胞充當(dāng)種子，骨髓微環(huán)境充當(dāng)土壤。在腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶脫落開始直至新的轉(zhuǎn)移灶形成的過程中，這種方法建立的骨轉(zhuǎn)移模型模擬的是腫瘤細(xì)胞從進(jìn)入血液循環(huán)開始，隨著血流到達(dá)骨的毛細(xì)血管床、穿過血管內(nèi)皮間隙進(jìn)入骨組織、與骨組織微環(huán)境經(jīng)過一系列相互作用、在骨內(nèi)增殖和導(dǎo)致骨質(zhì)重構(gòu)的過程；這與脛骨內(nèi)注射法建立的乳腺癌及前列腺癌等惡性腫瘤的骨轉(zhuǎn)移模型相比更接近于腫瘤轉(zhuǎn)移的真實(shí)過程，因?yàn)楹笳吣M的只是腫瘤細(xì)胞定位于骨組織后的過程；所以，使用左心室注射的方法建立的肺癌骨轉(zhuǎn)移模型形成的骨轉(zhuǎn)移灶更與臨床相似；并且，脛骨內(nèi)接種的方法表現(xiàn)的骨轉(zhuǎn)移主要為長骨骨干轉(zhuǎn)移，這與臨床上常見的椎體及骨骺端轉(zhuǎn)移有所不同。

但左心室注射法由于易導(dǎo)致腦、肺、腎上腺皮質(zhì)等其他部位和器官多發(fā)性轉(zhuǎn)移的缺點(diǎn)[15-16]，以致骨轉(zhuǎn)移灶尚未形成，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物已死于其他部位轉(zhuǎn)移；再加上樣本量有限等，可能導(dǎo)致了本實(shí)驗(yàn)中盡管我們選用的四種肺腺癌細(xì)胞系體外侵襲、遷移能力均按A549、H1299、SPC-A-1、XL-2的順序由高到低排列，但體內(nèi)四個(gè)實(shí)驗(yàn)組骨轉(zhuǎn)移率的高低以及出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移所用平均時(shí)間的長短卻未呈這樣的順序排列。至于導(dǎo)致這種現(xiàn)象的具體原因，還有待于以后更進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探索。

與傳統(tǒng)的放射學(xué)技術(shù)相比，MicroCT分辨率高、不存在圖像重疊、偽影、比例放大等不足；與傳統(tǒng)的組織學(xué)切片技術(shù)相比，MicroCT能夠在不破壞樣品的情況下對骨組織、活體小動(dòng)物進(jìn)行成像，還能精確進(jìn)行圖像三維重建，它成為我們判斷骨組織破壞情況較為精準(zhǔn)的方法之一。

總之，我們成功地建立了肺腺癌骨轉(zhuǎn)移裸小鼠模型，成為研究肺腺癌乃至肺癌骨轉(zhuǎn)移分子機(jī)制、探索出新的臨床預(yù)防和治療方案不可缺少的工具。