劉 剛 張雁南 杜乾坤 范澤慧

（吉林工程技術(shù)師范學(xué)院食品工程學(xué)院，吉林 長春 130052）

水紅花子是紅蓼的干燥成熟果實，有健脾消食、化痞散結(jié)、清熱明目、抑菌等作用［1］。已有研究［1－3］證明，水紅花子富含黃酮類化合物，主要成分有槲皮素、花旗松素、3，5，7－三羥基色原酮等?；ㄆ焖伤兀╰axifolin）是一種二氫黃酮醇類化臺物，化學(xué)名為5，7，3′，4′－四羥基二氫黃酮醇［4］。屬生物類黃酮擬維生素P，也稱黃杉素、紫杉葉素、二氫化槲皮素（di－h(huán)ydroquercetin，DHQ）［5］。花旗松素具有抗氧化、抗輻射、抗病毒、抗腫瘤、保護(hù)細(xì)胞內(nèi)酶等活性作用［4－6］。已作為一種安全的食品添加劑（抗氧劑）被廣泛用于植物油、動物油、奶粉、含脂糕點等食品的保鮮，還開發(fā)出功能性飲料及相應(yīng)的食品［5］。市場上的花旗松素大都是以落葉松為原料制得，紅蓼分布廣泛，是以種子繁殖的一年生草本植物，從其種子水紅花子中提取花旗松素不但提高了紅蓼的經(jīng)濟價值，也擴大了花旗松素的來源。目前關(guān)于花旗松素，特別是水紅花子中花旗松素提取工藝研究未見報道。

響應(yīng)曲面分析法以較少試驗次數(shù)和較短時間對所選試驗參數(shù)進(jìn)行全面研究，在天然藥物有效成分提取等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用［7］。本研究以水紅花子為原料，利用響應(yīng)面法對乙醇回流法提取花旗松素的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，為水紅花子功能成分的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水紅花子：采自長春市郊，成熟、干燥、形態(tài)完整；

無水乙醇、甲醇：分析純，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；

花旗松素標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥98%，中國藥品生物制品檢定所。

1.2 儀器與設(shè)備

微型植物試樣粉碎機；FZ102型，河北省黃驊市齊家務(wù)科學(xué)儀器廠；

鼓風(fēng)干燥箱；DHG－9075A型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

臺式循環(huán)水式真空泵；SHZ－ⅢA型，鄭州英峪領(lǐng)科儀器設(shè)備有限公司；

電子天平；AL204型，梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司；

紫外可見分光光度計；S53型，上海棱光有限公司；

水浴鍋；HH－S4型，金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 花旗松素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取花旗松素對照品5.0mg，用甲醇溶解于50mL容量瓶中，甲醇定容，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液。分別精密吸取 0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液于10mL容量瓶中，甲醇定容，以溶劑作空白，在最大吸收波長290nm處用紫外可見分光光度計測各溶液吸光度［8］，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖1），得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y ＝0.046 1x＋0.001 3，R2＝0.999 6。

圖1 花旗松素標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 The standard curve of taxifolin

根據(jù)回歸方程計算樣品液中花旗松素的含量，計算水紅花子花旗松素的提取量：

1.3.2 花旗松素的提取 將水紅花子干燥，粉碎，過60目篩。稱取5.00g水紅花子粉末，加入一定量的乙醇溶液，室溫下浸泡30min，之后在一定溫度下回流提取一定時間，提取1次，過濾，殘渣用相應(yīng)濃度的乙醇溶液洗滌數(shù)次，濾液和洗液轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶中，用相應(yīng)濃度的乙醇定容，再稀釋10倍，在290nm處測定吸光度值，計算花旗松素提取量。

1.3.3 試驗設(shè)計

（1）單因素試驗：以花旗松素提取量為評價指標(biāo)，考察各因素對花旗松素提取量的影響?；A(chǔ)試驗條件：水紅花子粉末5.00g、乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)55%、料液比1∶15（m∶V）、提取溫度65℃、提取時間1h、提取1次。單因素試驗設(shè)計：乙 醇 溶 液 體 積 分 數(shù)35%，45% ，55%，65%，75% ，85%，95%；提取溫度35，45，55，65，75，85，95 ℃；提取時間1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0h；料液比1∶9，1∶12，1∶15，1∶18，1∶21，1∶24，1∶27（m∶V）。

（2）中心組合試驗設(shè)計：在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Design Expert 7.0.0軟件，根據(jù) Box－Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理［9，10］，設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗優(yōu)化水紅花子中花旗松素的乙醇回流提取工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對花旗松素提取量的影響 由圖2可知，隨著溶劑體積分?jǐn)?shù)的提高，花旗松素提取量增大，體積分?jǐn)?shù)在65%時，提取量達(dá)到最大；體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大，花旗松素提取量降低。乙醇水溶液隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而極性減小，花旗松素是多酚羥基化合物［5］，其極性比無水乙醇強比水弱，試驗結(jié)果說明花旗松素的極性與體積分?jǐn)?shù)65%的乙醇溶液相似。而且隨著乙醇濃度增加，脂溶性雜質(zhì)溶出量增加，對花旗松素吸光度的測定也會存在干擾，因此乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇在55%～75%較為適宜。

圖2 乙醇濃度對花旗松素提取量的影響Figure 2 The influence of ethanol concentration on taxifolin extraction yield

2.1.2 提取溫度對花旗松素提取量的影響 由圖3可知，花旗松素的提取量隨著提取溫度的提高而增加。溫度的升高，有助于傳質(zhì)過程，使分子擴散運動激烈，加快溶質(zhì)的擴散和溶劑的滲透［11］。溫度過高，黃酮類化合物容易被氧化而受到破壞，溶劑容易揮發(fā)［12］。綜合考慮，提取溫度在95℃較為適宜。

2.1.3 提取時間對花旗松素提取量的影響 由圖4可知，花旗松素提取量隨提取時間的增大而增大，當(dāng)時間達(dá)到3h后，隨提取時間的增加提取量的提高不明顯。這主要是由于隨著提取時間的延長，細(xì)胞內(nèi)外濃度達(dá)到平衡，活性成分不再溶出［13］。因此，選擇提取時間在3h左右較為合適。

圖3 提取溫度對花旗松素提取量的影響Figure 3 The influence of extracting temperature on taxifolin extraction yield

圖4 提取時間對花旗松素提取量的影響Figure 4 The influence of extracting time on taxifolin extraction yield

2.1.4 料液比對花旗松素提取量的影響 由圖5可知，花旗松素提取量隨著料液比的減小先增大，當(dāng)料液比降到1∶18（m∶V）以后提取量下降。由此可見，增加溶劑用量有利于花旗松素的溶出，但溶劑用量過大，雜質(zhì)溶出量增加，干擾測定，使提取量下降，同時造成溶劑的浪費。因此選擇料液比為1∶15～1∶21（m∶V）較合適。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計與結(jié)果分析 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，固定提取提取溫度95℃和提取次數(shù)1次，以花旗松素提取量為響應(yīng)值，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、料液比為自變量進(jìn)行響應(yīng)面分析設(shè)計試驗（表1）。

表1 中心組合設(shè)計的因素與水平Table 1 Variables and levels in central composite design

對所得的試驗數(shù)據(jù)（表2）進(jìn)行多元回歸擬合，得到多元二次回歸方程：

表2 中心組合試驗方案與結(jié)果Table 2 Central composite design matrix and corresponding results

由表3可知，模型達(dá)到極顯著水平（P＜0.000 1）；方程的失擬誤差P＝0.325 3，表現(xiàn)為不顯著；模型的相關(guān)系數(shù)R2＝0.994 3，說明響應(yīng)值的變化有99.43%來源于所選變量［14］；方差分析結(jié)果中，X1、X2、X3、X21、X22、X23對試驗結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），X1X2對試驗結(jié)果影響顯著（P＜0.05），其他項不顯著；各因素對花旗松素提取量的影響大小，提取時間影響最大，其次是乙醇體積分?jǐn)?shù)，料液比影響最小。

2.2.2 各兩因素交互作用對花旗松素提取量的影響 響應(yīng)曲面的坡度越陡峭，表明響應(yīng)值對因素的改變越敏感。等高線揭示了交互作用的規(guī)律，圖中等值線密的方向，對應(yīng)的坐標(biāo)所表示的因素為交互作用的主要方面［15］。由圖6可知，X1和X2交互作用顯著，各因素對花旗松素提取量影響的大小順序為X2＞X1＞X3，這與方差分析結(jié)果一致。

2.2.3 花旗松素提取工藝條件的確定 由回歸模型預(yù)測的工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)62.52%、提取時間3.37h、料液比1∶19.29（m∶V），預(yù)測花旗松素提取量理論值5.95mg／g。為了試驗操作簡便，調(diào)整工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)63%、提取時間3.4h、料液比1∶19（m∶V），得到的提取量是5.94mg／g，說明預(yù)測值與實際值之間有很好的擬合性，采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的花旗松素提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

表3 方差分析結(jié)果?Table 3 Result of analysis of variance

圖6 響應(yīng)面分析圖Figure 6 Response surface

結(jié)合上述優(yōu)化條件，考察提取次數(shù)對花旗松素提取量的影響，精密稱取5.00g水紅花子粉末，反復(fù)回流提取3次，收集各次提取液，稀釋，在290nm處測定花旗松素溶液的吸光度，計算各處理的花旗松素提取量。

由圖7可知，隨著提取次數(shù)的增加，花旗松素提取量明顯下降，3次提取的總提取量為7.42mg／g，第1次的提取量5.94mg／g，第2次的提取量為1.26mg／g，第3次的提取量為0.22mg／g，提取2次的提取量總和為7.2mg／g，占總提取量的97.04%。提取2次后，水紅花子中花旗松素殘留量已經(jīng)很少，因此，確定提取次數(shù)為2次。綜上得出水紅花子花旗松素的提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)63%、提取時間3.4h、料液比1∶19（m∶V）、提取溫度95℃、提取2次。

3 結(jié)論

圖7 提取次數(shù)對花旗松素提取率的影響Figure 7 The influence of extraction times on taxifolin extraction yield

本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化水紅花子中花旗松素的乙醇回流提取工藝，得出最佳提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)63%、提取時間3.4h、料液比1∶19（m∶V）、提取溫度95℃、提取2次，此時花旗松素提取量為7.2mg／g。影響花旗松素提取量的各因素的大小順序為提取時間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞料液比。

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