唐 鑫 夏延斌 吳 燦

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128）

植物乳桿菌既是生產(chǎn)發(fā)酵泡菜、發(fā)酵谷物、發(fā)酵肉制品等的重要微生物菌群之一［1］，也是人體益生菌［2－4］。其產(chǎn)品因具有改善人體腸道環(huán)境和增強(qiáng)機(jī)體免疫力等保健功能而受到越來越多的消費(fèi)者的喜愛［5－9］。湖南是一個(gè)辣椒大省，當(dāng)?shù)氐睦苯芳庸て髽I(yè)在辣椒制品的生產(chǎn)過程中，鹽漬辣椒會(huì)滲出大量的高含鹽量及營養(yǎng)物質(zhì)豐富的辣椒汁［10］，該汁被當(dāng)做廢液直接排掉，不僅造成營養(yǎng)物質(zhì)的流失，而且污染環(huán)境。目前，乳酸菌最常用的培養(yǎng)基是 MRS培養(yǎng)基，由于MRS培養(yǎng)基的成本比較高，配制麻煩，而且其菌液不是食品級(jí)的原料［11］，故不能直接接入食品中用于生產(chǎn)。因此利用鹽漬辣椒汁為基質(zhì)的食品級(jí)培養(yǎng)基進(jìn)行菌種的擴(kuò)培和種子液的制備，不僅可以節(jié)約生產(chǎn)成本，廢物利用，保護(hù)環(huán)境，還可以將種子液直接接種于發(fā)酵辣椒制品中，方便生產(chǎn)。同時(shí)通過培養(yǎng)基的優(yōu)化設(shè)計(jì)可提高菌液中活菌的含量［12］。本試驗(yàn)利用響應(yīng)面法優(yōu)化以鹽漬辣椒滲出汁為基質(zhì)的植物乳桿菌培養(yǎng)基，為發(fā)酵辣椒制品種子液的制備以及發(fā)酵辣椒的生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

鹽漬辣椒滲出汁：壇壇香調(diào)味品有限公司。

1.1.2 菌種

植物乳桿菌 （L.plantarumP1）：由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.3 試劑

MRS肉湯：廣東懷凱微生物技術(shù)有限公司；

胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、細(xì)菌學(xué)蛋白胨、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO4等：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.4 儀器與設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱：GZ－250－S型，韶關(guān)市廣智科技設(shè)備發(fā)展有限公司；

電子天平：TP－213型，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；

超凈工作臺(tái)：SW－CJ－1FD型，蘇州凈化設(shè)備有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：WS2－84－64型，上海醫(yī)用核子儀器廠；

pH計(jì)：雷磁PHS－3C型，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 鹽漬辣椒滲出汁的預(yù)處理 將鹽漬辣椒滲出汁直接加熱蒸發(fā)濃縮至原體積的20%，靜置冷卻以除去底部冷析出來的食鹽。再加入蒸餾水使辣椒濃縮汁與水的體積比為1∶4，制得辣椒汁備用。

1.2.2 菌濃度的測(cè)定 采用菌落平板計(jì)數(shù)法［13］測(cè)定菌落數(shù)，計(jì)算發(fā)酵液體培養(yǎng)基中的植物乳桿菌濃度。

1.2.3 種子液的制備 轉(zhuǎn)接斜面菌種于 MRS液體培養(yǎng)基中，置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24h，備用。

1.2.4 培養(yǎng)基的優(yōu)化

（1）不同碳源、氮源、磷源對(duì)植物乳桿菌培養(yǎng)的影響：在辣椒汁的基礎(chǔ)上，選擇蔗糖、麥芽糖、乳糖、葡萄糖4種碳源，質(zhì)量分?jǐn)?shù)都為4%；選擇蛋白胨、胰蛋白胨、酵母膏、牛肉膏4種氮源，質(zhì)量分 數(shù)都為2%；選擇 K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO44種磷源，質(zhì)量分?jǐn)?shù)都為0.1%，其他組分均不變進(jìn)行單因素試驗(yàn)，按2%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，初始pH為6.0，培養(yǎng)溫度35℃，置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24h，測(cè)定培養(yǎng)液的菌濃度并進(jìn)行比較。

（2）碳源、氮源、磷源的添加量對(duì)植物乳桿菌培養(yǎng)的影響：選擇上述試驗(yàn)的最佳碳源、氮源、磷源。碳源的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別選擇2%，4%，6%，8%，10%；氮源的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別選擇1%，1.5%，2%，2.5%，3%；磷源的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別選擇0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。按2%接種量接種，初始pH為6.0，培養(yǎng)溫度35℃，置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24h，測(cè)定培養(yǎng)液的菌濃度并進(jìn)行比較。

（3）響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基：選擇上述最佳的碳源、氮源、磷源以及合適的添加量，采用三因素三水平，利用Expert－Design 8.0.5軟件，采用 Box－Behnken Design響應(yīng)面法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以植物乳桿菌培養(yǎng)基菌濃度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定培養(yǎng)基的最優(yōu)配方。

1.2.5 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

（1）接種量對(duì)植物乳桿菌培養(yǎng)的影響：分別選擇接種量為1%，2%，3%，4%，5%，接種種子液于已優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基中，初始pH為6.0，培養(yǎng)溫度35℃，置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24h，測(cè)定培養(yǎng)液的菌濃度并進(jìn)行比較，選擇最佳接種量。

（2）溫度對(duì)植物乳桿菌培養(yǎng)的影響：按上一步所得的最佳接種量接種種子液于發(fā)酵培養(yǎng)基中，初始pH為6.0，分別置于25，30，35，40，45℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24h，測(cè)定培養(yǎng)液的菌濃度并選擇最適宜溫度。

（3）pH值對(duì)植物乳桿菌培養(yǎng)的影響：將已優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基pH 值分別調(diào)為4.0，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，按最佳接種量接種和最適宜溫度靜置培養(yǎng)24h，測(cè)定其菌濃度進(jìn)行比較，得到最佳pH值。

1.2.6 生長曲線的測(cè)定 根據(jù)上述所得的優(yōu)化后的培養(yǎng)基，按最佳條件培養(yǎng)，每隔3h測(cè)定其菌濃度和還原糖的含量，繪制生長曲線［14］。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基的優(yōu)化

圖1 碳源對(duì)植物乳桿菌菌濃度的影響Figure 1 Effects of carbon sources on bacteria concentration of L.plantarum

圖2 氮源對(duì)植物乳桿菌菌濃度的影響Figure 2 Effects of nitrogen sources on bacteria concentration of L.plantarum

2.1.1 碳源、氮源、磷源的選擇 不同的碳源、氮源、磷源對(duì)植物乳桿菌菌濃度的影響見圖1～3。由圖1可知，當(dāng)葡萄糖作為碳源時(shí)，菌濃度是最高的，可達(dá)4.5×1010CFU／mL。而其他糖類作為碳源時(shí)差距并不大。可能是因?yàn)橹参锶闂U菌不能利用復(fù)雜的碳水化合物［7］，因此葡萄糖作為碳源更適合菌體的生長。因?yàn)樵诰w的培養(yǎng)過程中，已有報(bào)道［1］顯示有機(jī)氮源比無機(jī)氮源更適合菌體的生長，所以本次試驗(yàn)選擇了4種有機(jī)氮源進(jìn)行比較。由圖2可知，蛋白胨為最適合植物乳桿菌生長的氮源。由圖3可知，在4種磷酸鹽作為磷源的條件下，K2HPO4為最適合的磷源。綜上所述，選擇葡萄糖、蛋白胨、K2HPO4分別作為辣椒汁發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源、氮源和磷源進(jìn)行添加量選擇的單因素試驗(yàn)。

圖3 磷源對(duì)植物乳桿菌菌濃度的影響Figure 3 Effects of phosphate sources on bacteria concentration of L.plantarum

2.1.2 碳源、氮源、磷源添加量的選擇 由圖4可知，當(dāng)葡萄糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)添加到4%時(shí)，菌體濃度隨葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而提高，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于4%時(shí)，菌體濃度開始下降，因此選擇葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%為最佳添加量；由圖5可知，菌體濃度隨著蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而提高，當(dāng)?shù)鞍纂速|(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到2.5%時(shí)達(dá)到最大值，之后開始下降，因此選擇蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%為最佳添加量；由圖6可知，K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%時(shí)，菌濃度達(dá)到最大值，可能是因?yàn)镵2HPO4含量的增加對(duì)培養(yǎng)基的pH造成影響所致。

圖4 葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)植物乳桿菌培養(yǎng)的影響Figure 4 Effects of glucose concentrations on bacteria concentration of L.plantarum

圖5 蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)植物乳桿菌培養(yǎng)的影響Figure 5 Effects of pepton concentrations on bacteria concentration of L.plantarum

圖6 K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)植物乳桿菌培養(yǎng)的影響Figure 6 Effects of K2HPO4concentrations on bacteria concentration of L.plantarum

2.1.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，根據(jù)Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為自變量，菌濃度為響應(yīng)值對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)因素水平編碼見表1，設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。

表1 辣椒汁發(fā)酵培養(yǎng)基響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平表Table 1 Factors and levels of response surface design／%

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Scheme and results of response surface design

利用 Design－Expert 8.0.5對(duì)表中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合并對(duì)模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。各因素經(jīng)二次多項(xiàng)回歸擬合后，得到二次多項(xiàng)回歸方程：

由表3可知，該模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)平方R2＝0.986 0，與校正后相關(guān)系數(shù)平方R2Adj＝0.967 9接近，說明該模型與實(shí)際擬合度好，各具體試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系，因此可以用于模型分析。

表3 回歸模型方差分析表?Table 3 Variance analysis of the established regression equation for L.plantarum

由表3回歸分析結(jié)果可知，模型的F 值為54.67，P＜0.000 1，說明該模型是極顯著的。一次項(xiàng) X1、X2、X3，交互項(xiàng)X1X2，二次項(xiàng)差異均為極顯著。失擬項(xiàng)的P＝0.262 8，說明失擬項(xiàng)在0.05水平上不顯著，殘差均由隨機(jī)誤差引起。因此可利用該回歸模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化分析，確定植物乳桿菌辣椒汁發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳配方。

2.1.4 響應(yīng)面分析及優(yōu)化 響應(yīng)面分析方法的圖形是特定的響應(yīng)面對(duì)應(yīng)的因素葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)所構(gòu)成的三維空間圖。曲面圖的形狀可反應(yīng)出各個(gè)因素對(duì)菌濃度的影響，曲面越陡峭，影響越顯著［15］。由圖7可知，三因素值選擇合理，驗(yàn)證了模型的準(zhǔn)確。為進(jìn)一步確定培養(yǎng)基的最佳配比，用Design－Expert 8.0.5軟件進(jìn)行數(shù)值優(yōu)化分析，獲得最優(yōu)的配比為葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.51%、蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.13%、K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.22%，在此條件下得到菌濃度的理論值為4.93×1010CFU／mL。實(shí)際操作進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果得到培養(yǎng)液菌濃度為4.79×1010CFU／mL，與理論值較為吻合。

2.2 培養(yǎng)條件的選擇

由圖8可知，當(dāng)接種量在2%時(shí)菌濃度最高，隨著接種量增加，菌體生長效果受到影響，可能是因?yàn)榘l(fā)酵初期培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)不能滿足過量植物乳桿菌的生長所需；這是由于接種進(jìn)該研究中的培養(yǎng)基即一般MRS培養(yǎng)基的菌濃度本身不高于本培養(yǎng)基優(yōu)化后的濃度，且當(dāng)接種量過高時(shí)，該培養(yǎng)基并不適于植物乳桿菌的生長，使其生長所需營養(yǎng)物質(zhì)不足，所以當(dāng)接種量過高時(shí)，菌種會(huì)出現(xiàn)生長緩慢導(dǎo)致的菌濃度偏低現(xiàn)象，并非抑菌現(xiàn)象。由圖9可知，在35～40℃時(shí)，菌體濃度較高，可能是因?yàn)檫^低的溫度會(huì)降低酶活力使菌體生長較慢，而過高的溫度則會(huì)使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性影響菌體的生長；由圖10可知，在pH為6.5時(shí)，菌體生長最好，所以最佳pH應(yīng)控制在6.5左右。

2.3 生長曲線的測(cè)定

確定培養(yǎng)基的配比和培養(yǎng)條件后，用最佳培養(yǎng)基配方和最適宜生長條件培養(yǎng)植物乳桿菌，繪制其生長曲線及還原糖含量變化曲線，見圖11。由圖11可知，植物乳桿菌在辣椒汁發(fā)酵培養(yǎng)基上約在6h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間到達(dá)21h左右時(shí)，菌體生長進(jìn)入穩(wěn)定期，27h后菌體逐漸開始衰亡。由此可得，菌株的種齡為21h，發(fā)酵周期為27h，在優(yōu)化后的條件下，活菌數(shù)可以達(dá)到4.9×1010CFU／mL。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵鹽漬辣椒滲出汁培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，并得到回歸方程。經(jīng)分析，確定培養(yǎng)基的最佳配方為葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.51%、蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.13%、K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.22%，在此條件下的平均實(shí)際菌濃度為4.79×1010CFU／mL，與理論值4.93×1010CFU／mL接近。并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究其培養(yǎng)條件，在接種量2%、培養(yǎng)溫度35℃、初始pH 6.5、發(fā)酵時(shí)間21h后，菌濃度可達(dá)到4.9×1010CFU／mL。此時(shí)該發(fā)酵液用于發(fā)酵辣椒制品效果最好。

圖7 各兩因素交互作用對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基菌濃度影響的響應(yīng)面及等高線圖Figure 7 Response surface and contour plots showing the interactive effects of three parameters on the bacteria concentration of fermentation medium

圖8 接種量對(duì)植物乳桿菌菌濃度的影響Figure 8 Effects of inoculation amount on bacteria concentration of L.plantarum

圖9 培養(yǎng)溫度對(duì)植物乳桿菌菌濃度的影響Figure 9 Effects of culture temperature on bacteria concentration of L.plantarum

圖10 pH值對(duì)植物乳桿菌菌濃度的影響Figure 10 Effects of pH on bacteria concentration of L.plantarum

圖11 植物乳桿菌生長曲線及還原糖含量的變化Figure 11 Growth curve of L.plantarumand change of sugar content

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