文 欣 劉素純 黃曉晗

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.湖南省發(fā)酵食品工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

蟬花（cordyceps sobolifera）亦稱蟬蛹草，是蟬花真菌寄生于蟬類若蟲(chóng)而形成的結(jié)合體，因其需要特定的環(huán)境和宿主，故資源稀少。主要分布于中國(guó)浙江、江蘇、四川等多省份，在世界各地也有所分布［1］。其入藥形態(tài)為寄生于蟬蛹形成的結(jié)合體，無(wú)毒，性寒，味甘，能散風(fēng)熱、解痙，主治兒童驚風(fēng)夜啼、咳嗽、咬牙、咽喉癰腫等病癥［2］。在《證類本草》中記載蟬花主要用于“小兒驚癇瘈疭、夜啼、心悸”；《本草綱目》中記載其藥效“功同蟬蛻，又止瘧疾”。

蟬花中含有真菌多糖、蟲(chóng)草酸、蟲(chóng)草素及麥角甾醇等多種活性物質(zhì)［3］，活性物質(zhì)的多少與寄生類型關(guān)系較大。楊介鉆等［4］、金麗琴等［5］證明蟬花及其菌絲體具有較好的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜及解熱等功效，同時(shí)蟬花對(duì)機(jī)體的毒性甚微，其主要化學(xué)成分與冬蟲(chóng)夏草（cordyceps sinensis）相似。由于近年來(lái)蟬花生存環(huán)境遭到破壞，再之過(guò)度采挖，蟬花已經(jīng)成為一種珍貴的藥材，故利用人工培養(yǎng)蟬花具有廣闊的前景。葛飛等［6］對(duì)天然蟬花中的粗成分進(jìn)行了分析，其中粗蛋白含量為19.65%、粗脂肪含量為8.41%、粗纖維含量為3.12%、灰分為7.84%、水分含量為9.81%，蟲(chóng)草酸含量為53.6mg／g，真菌多糖含量為33.2mg／g。

本試驗(yàn)對(duì)蟬花中的真菌進(jìn)行分離，通過(guò)液態(tài)培養(yǎng)獲得該菌種的菌絲體，并對(duì)蟬花菌絲體中的化學(xué)成分以及活性物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定分析，為將來(lái)用蟬花真菌菌絲體替代天然蟬花作為保健品和藥品原料等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)原料

蟬花：采自九江市廬山區(qū)蓮花鎮(zhèn)蓮花林場(chǎng)。

1.1.2 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基：孟加拉紅培養(yǎng)基；

菌種保存培養(yǎng)基：PDA斜面培養(yǎng)基；

固態(tài)種子培養(yǎng)基：麩皮培養(yǎng)基。將麩皮和水以1∶1（m∶m）的比例混合，然后裝入500mL的三角瓶?jī)?nèi)，厚度大約0.5cm，在121℃條件下滅菌30min，備用；

液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：PDA液態(tài)培養(yǎng)基；

改良PDA液態(tài)培養(yǎng)基：200g新鮮馬鈴薯、10g干蟬蛻放入沸水中煮20min，用紗布過(guò)濾去殘?jiān)尤?0g葡萄糖，補(bǔ)水到1 000mL；

Richard培養(yǎng)基：KH2PO45g，MgSO4·7H2O 2.5g，KNO310g，蔗糖50g，F(xiàn)eCl30.02g，H2O 1 000mL；

蛋白胨－葡萄糖－酵母膏培養(yǎng)基：葡萄糖10g，酵母膏10g，蛋白胨5g，水1 000mL；

麩皮－玉米：取麩皮10g，玉米粒10g，置于沸水中煮20min，用紗布過(guò)濾去掉固形物，再加入10g蔗糖，補(bǔ)水至1 000mL。

1.2 方法

1.2.1 蟬花真菌的分離培養(yǎng) 稱取10g天然蟬花樣品加入到90mL無(wú)菌生理鹽水中，振蕩30min。將其稀釋成10－3，10－4，10－5稀釋液，從各稀釋液中吸取0.1mL到孟加拉紅平板并涂布，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5d。挑選單個(gè)典型的菌落，接種到PDA斜面培養(yǎng)基中，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蟬花真菌鑒定 用點(diǎn)接法將蟬花真菌接種到PDA平板上進(jìn)行菌落形態(tài)觀察；用插片法對(duì)蟬花真菌進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)顯微鏡作個(gè)體形態(tài)觀察。

1.2.3 液態(tài)培養(yǎng)生物量的獲得

（1）孢子懸液的制備：在無(wú)菌條件下挑取斜面蟬花真菌，接種到麩皮培養(yǎng)基中，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。取5g培養(yǎng)好的麩皮菌種加入到45mL無(wú)菌水中，震蕩30min，即為孢子懸液。用血球計(jì)數(shù)板測(cè)量菌懸液中孢子的數(shù)量，加入無(wú)菌生理鹽水將孢子的濃度調(diào)到106個(gè)／mL。

（2）蟬花真菌液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇：取5mL孢子懸液，分別加入到100mL的蛋白胨－葡萄糖－酵母膏培養(yǎng)基、PDA液態(tài)培養(yǎng)基、改良PDA液態(tài)培養(yǎng)基、Richard培養(yǎng)基、玉米－麩皮培養(yǎng)基中，置于溫度為28℃的搖床中以150r／min的速率進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為7d。從第3天開(kāi)始，每隔24h對(duì)發(fā)酵液中的生物量進(jìn)行測(cè)定，從而選擇最優(yōu)培養(yǎng)基。

（3）蟬花真菌液態(tài)發(fā)酵的最佳溫度的選擇：用無(wú)菌移液管取孢子懸液5mL，加入到裝有100mL改良PDA液態(tài)培養(yǎng)基的三角瓶中。將恒溫?fù)u床的溫度分別設(shè)置為22，24，26，28，30℃，搖床速率為150r／min，培養(yǎng)5d。測(cè)定其生物量。

（4）蟬花真菌液態(tài)發(fā)酵的最佳接種量的選擇：以接種量為1%，2%，3%，4%，5%分別將孢子懸液接種到改良PDA培養(yǎng)基中，于28℃的恒溫?fù)u床中以150r／min的速率培養(yǎng)5d。測(cè)定其生物量。

（5）蟬花真菌液態(tài)發(fā)酵過(guò)程中搖床轉(zhuǎn)速的選擇：從孢子懸液中吸取5mL菌液，加入到裝有100mL的改良PDA培養(yǎng)基的三角瓶中，將其放置在轉(zhuǎn)速為110，130，150，170，190r／min的恒溫?fù)u床上，在28℃條件下恒溫培養(yǎng)5d。測(cè)定其生物量。

（6）正交法確定蟬花真菌最優(yōu)培養(yǎng)條件：選擇溫度、接種量和搖床轉(zhuǎn)速為試驗(yàn)因素，設(shè)計(jì)L9（33）正交試驗(yàn)以獲得最佳發(fā)酵條件。

1.2.4 測(cè)定方法

（1）生物量的測(cè)定方法：發(fā)酵液培養(yǎng)完成后進(jìn)行冷凍離心，離心溫度為10℃、速率為4 000r／min、時(shí)間為15min。棄掉上清液，將菌絲體收集于玻璃紙上放在60℃烘箱中干燥，再進(jìn)行稱量，此重量即為發(fā)酵液中的生物量。

（2）菌絲體粗成分的分析：水分含量的測(cè)定采用直接干燥法［7］；總氮含量的測(cè)定采用凱氏定氮法［8］；粗脂肪含量的測(cè)定采用索氏提取法［9］；粗纖維含量的測(cè)定采用酸堿消煮法［10］；灰分含量的測(cè)定法采用灼燒法［11］。

（3）蟲(chóng)草酸的測(cè)定：根據(jù)文獻(xiàn)［12］所述方法，用微波提取法進(jìn)行提取菌絲體中的蟲(chóng)草酸。蟲(chóng)草酸測(cè)定方法采用高碘酸鈉比色法［13］。將測(cè)量獲得的OD值代入回歸方程中，然后通過(guò)式（1）計(jì)算菌絲體中蟲(chóng)草酸的含量。

式中：

R——菌絲體中蟲(chóng)草酸含量，mg／g；

C—— 提取液中蟲(chóng)草酸含量，μg／g；

10—— 試樣浸提后定容體積，mL；

V——提取液體積，mL；

m——試樣的準(zhǔn)確重量，g。

（4）真菌多糖含量的測(cè)定：將干燥后的菌絲體進(jìn)行前處理，包括：提取、醇沉、脫色、去蛋白、干燥［14］。真菌多糖的測(cè)定采用硫酸－苯酚法［15］。將測(cè)量獲得的OD值通過(guò)回歸曲線進(jìn)行計(jì)算，然后代入式（2）計(jì)算出多糖含量。

式中：

R——菌絲體中真菌多糖含量，mg／g；

C—— 提取液中真菌多糖含量，μg／mL；

V——定容后體積，mL；

w——干菌絲體質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的篩選

觀察孟加拉紅平板，發(fā)現(xiàn)一真菌在數(shù)量上占有優(yōu)勢(shì)。經(jīng)分離純化后，點(diǎn)接在PDA平板中觀察該菌落形態(tài)。如圖1，剛開(kāi)始菌落圓形呈白色，菌絲平伏、氈狀，與培養(yǎng)基結(jié)合緊密，不易挑取，質(zhì)地致密，菌落呈放射狀溝紋，橢圓形；形成孢子后，菌落呈灰綠色。在顯微鏡下觀察該菌個(gè)體形態(tài)（圖2），發(fā)現(xiàn)菌絲有隔，基部無(wú)足細(xì)胞，分生孢子以簇生形式分布于營(yíng)養(yǎng)菌絲或孢子梗上，圓形或近似球形，其分生孢子梗經(jīng)過(guò)多次分枝，產(chǎn)生對(duì)生的瓶狀小梗，呈掃帚狀；可初步判定其為蟬擬青霉，命名為V17。

圖1 蟬花真菌的菌落形態(tài)觀察Figure 1 Fungal colony form of Cordyceps cicadae

圖2 蟬花真菌的個(gè)體形態(tài)觀察Figure 2 Individual form of Cordyceps cicadae

2.2 發(fā)酵液中生物量的獲得

2.2.1 蟬花真菌液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇 在液態(tài)搖床培養(yǎng)2d時(shí)，改良PDA培養(yǎng)基中最先形成菌絲體，個(gè)體較小，而其他培養(yǎng)基在第3天開(kāi)始才有較小的菌絲體形成（圖3）；隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，發(fā)酵液中的菌絲體中逐漸長(zhǎng)至黃豆般大小，發(fā)酵液的顏色也從暗黃色慢慢轉(zhuǎn)變到黑灰色。

從第3天開(kāi)始，每隔24h對(duì)發(fā)酵液中菌絲體的生物量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖3。在液態(tài)培養(yǎng)過(guò)程中，隨著時(shí)間的變化，改良PDA和PDA在第5天前發(fā)酵液中的生物量逐步增加，而其他3種培養(yǎng)基是在第6天前生物量逐步增加。其中，在改良PDA中進(jìn)行發(fā)酵的菌絲體在各個(gè)時(shí)間段的生物量均高于其他的培養(yǎng)基，在5d達(dá)到最大值，為5.26g／L。蟬花真菌本來(lái)是寄生于蟬蛹上生長(zhǎng)而得，在培養(yǎng)基中加入的蟬蛻熬液為該微生物的生長(zhǎng)提供了一些無(wú)機(jī)鹽或生長(zhǎng)因子，使得它的生長(zhǎng)速率得到提高。在5d之后，隨著發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的減少、細(xì)胞的活性降低，同時(shí)次級(jí)代謝產(chǎn)物的生成使得菌絲自溶，從而導(dǎo)致了發(fā)酵液中生物量的減少。

2.2.2 蟬花真菌液態(tài)發(fā)酵的最佳溫度 在不同溫度下對(duì)蟬花真菌進(jìn)行液態(tài)培養(yǎng)，結(jié)果見(jiàn)圖4。該菌株在改良PDA液態(tài)培養(yǎng)基24～32℃的條件下均能生長(zhǎng)，而在28℃時(shí)獲得的生物量最大，為5.26g／L。

圖3 蟬花真菌在不同培養(yǎng)基上發(fā)酵的生物量變化Figure 3 The biomass changed in five kinds of medium on liquid fermentation of Cordyceps cicadae

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)蟬花液態(tài)發(fā)酵的影響Figure 4 Effects of culture temperature on liquid fermentation of Cordyceps cicadae

2.2.3 蟬花真菌液態(tài)發(fā)酵的最優(yōu)接種量 以不同的接種量進(jìn)行接種，在改良PDA液態(tài)培養(yǎng)基28℃恒溫?fù)u床上培養(yǎng)5d，獲得的生物量見(jiàn)圖5。接種量的多少與發(fā)酵液中的生物量有著較密切的關(guān)系，隨著接種量的增加，發(fā)酵液中的生物量也增加，直到4%時(shí)獲得最大值，為4.91g／L；而當(dāng)增加到5%的時(shí)候，發(fā)酵液中的生物量有所減少。較少的接種量會(huì)使得發(fā)酵液中的菌濃度較少，使得生長(zhǎng)遲滯期較長(zhǎng)，不利于發(fā)酵；而過(guò)高的接種量會(huì)使得發(fā)酵液中菌過(guò)多而營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足，因而獲得的菌絲體較少。

圖5 接種量對(duì)蟬花液態(tài)發(fā)酵的影響Figure 5 Effects of inoculum size on liquid fermentation of Cordyceps cicadae

2.2.4 蟬花真菌液態(tài)發(fā)酵過(guò)程中的最佳搖床速率 將蟬花真菌以4%的接種量接種，置于不同轉(zhuǎn)速的恒溫?fù)u床上進(jìn)行培養(yǎng)，獲得生物量見(jiàn)圖6。由圖6可知：蟬花真菌在150r／min的轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)獲得的生物量最大，低于或高于該轉(zhuǎn)速時(shí)生物量較少。蟬花真菌是好氧微生物，較高搖床速率使得通氣量增加，對(duì)它的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用；但當(dāng)搖床的轉(zhuǎn)速過(guò)快，菌絲體的數(shù)量變少，這可能是培養(yǎng)過(guò)程中菌絲體碰撞過(guò)多而導(dǎo)致菌絲體難以成型。

圖6 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)蟬花液態(tài)發(fā)酵的影響Figure 6 Effects of shaking speed on liquid fermentation of Cordyceps cicadae

2.2.5 蟬花真菌液態(tài)培養(yǎng)最佳條件 選擇溫度、接種量和搖床轉(zhuǎn)速為試驗(yàn)因素，因素水平表見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因子水平表L9（33）Table 1 The table of factor and level in L9（33）orthogonal experiment

正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，影響蟬花真菌液態(tài)發(fā)酵生物量的各因素主次為C＞B＞A，即搖床速率對(duì)蟬花真菌液態(tài)發(fā)酵過(guò)程中生物量的影響最大，溫度次之，接種量的大小影響最小。最佳的發(fā)酵條件為A2B2C3，發(fā)酵液中的生物量為5.94g／L。

試驗(yàn)結(jié)果方差分析見(jiàn)表3。由表3可知，溫度和搖床速率對(duì)蟬花真菌液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中的生物量影響較大，在a＝0.05水平下顯著，說(shuō)明它們對(duì)蟬花真菌的生物量影響較大；而接種量在a＝0.05水平下不顯著，說(shuō)明接種量對(duì)蟬花真菌液態(tài)發(fā)酵的生物量影響不大。

2.3 蟬花菌絲體粗成分分析

對(duì)干燥的蟬花菌絲體中的粗成分進(jìn)行測(cè)定（粗蛋白含量、粗脂肪含量、粗纖維含量、水分含量和灰分含量）進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。菌絲體中，粗蛋白含量較高，為27.19%；粗脂肪、粗纖維的含量分別為7.79%，6.20%；而灰分含量較低。因蟬花液態(tài)發(fā)酵是純種培養(yǎng)，培養(yǎng)基中的N源和C源較為豐富，故菌絲體中粗蛋白的含量較高；而發(fā)酵液中無(wú)機(jī)元素不如蟬若蟲(chóng)的含量豐富，故灰分含量較低。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析Table 2 Extreme value analysis of orthogonal experiment

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 The variance analysis of orthogonal test

表4 蟬花菌絲體粗成分分析Table 4 Proximate compositions of fermented fermented mycelia of Cordyceps cicadae

2.4 蟬花菌絲體中的活性成分分析

2.4.1 蟲(chóng)草酸含量標(biāo)準(zhǔn)曲線與蟬花真菌含量標(biāo)準(zhǔn)曲線 根據(jù)高碘酸鈉比色法，作蟲(chóng)草酸（D－甘露醇）含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖7），蟲(chóng)草酸含量的回歸方程：y ＝0.010 0x＋0.019 4，R2＝0.999 3。根據(jù)硫酸－苯酚法，作真菌多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖8），真菌多糖含量的回歸方程：y ＝0.006 1x－0.032 3，R2＝0.997 1。

圖7 蟲(chóng)草酸（D－甘露醇）含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 7 Standard curve of D－mannitol

圖8 葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 8 Standard curve of glucose

2.4.2 蟬花菌絲體中蟲(chóng)草酸（D－甘露醇）和真菌多糖含量的測(cè)定 取0.050g干燥菌絲體加入10mL水進(jìn)行微波處理，處理完后經(jīng)8 000r／min離心后取上清液加入到50mL容量瓶中進(jìn)行定容。測(cè)量樣液的OD值以進(jìn)行蟲(chóng)草酸的測(cè)定。

稱取0.050g干燥菌絲體進(jìn)行前處理，處理完后裝入50mL容量瓶中用去離子水定容。測(cè)定樣液中的OD值，通過(guò)公式計(jì)算真菌多糖含量。

將測(cè)量所得的OD值通過(guò)線性回歸方程的計(jì)算得表5，由表5可知，菌絲體中蟲(chóng)草酸（D－甘露醇）和蟲(chóng)草多糖含量均高于天然蟬花中的含量，菌絲體蟲(chóng)草酸的含量為149.52mg／g約高出天然蟬花（53.6mg／g）2倍，真菌多糖的含量為115.11mg／g約高出天然蟬花（33.2mg／g）3倍［6］。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)蟬花中的真菌進(jìn)行了研究，分離出的蟬擬青霉系天然蟬花中主要真菌。通過(guò)對(duì)其的篩選和純化，獲得了較好的發(fā)酵菌種：該菌株可以脫離蟬花宿主進(jìn)行生長(zhǎng)，采用改良PDA培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行液體發(fā)酵，培養(yǎng)5d可獲得較大的生物量。蟬花真菌的液態(tài)培養(yǎng)最優(yōu)條件為28℃、接種量為4%、搖床轉(zhuǎn)速為150r／min。經(jīng)工藝優(yōu)化，蟬花菌絲體的產(chǎn)量為5.94g／L。蟬花菌絲體中的化學(xué)成分與天然蟬花含量較為接近，其中粗蛋白的含量為27.19%，粗纖維含量為6.20%，粗脂肪含量為7.79%，水分含量8.91%，灰分含量1.71%。蟬花菌絲體中蟲(chóng)草酸與真菌多糖這兩種活性物質(zhì)分別為149.52，115.11mg／g，比天然蟬花的含量要高。因此可以將蟬花菌絲體應(yīng)用于保健食品和藥品上來(lái)替代天然蟬花，這樣可以降低生產(chǎn)成本。本試驗(yàn)未研究蟬花菌絲體中蟲(chóng)草素和麥角甾醇等活性物質(zhì)，在后續(xù)的試驗(yàn)中可對(duì)其他物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，這樣有利于進(jìn)一步證明蟬花真菌菌絲體的食用價(jià)值和藥用價(jià)值。

表5 蟬花菌絲體中蟲(chóng)草酸和真菌多糖的含量Table 5 Contents of D－mannitol and polysaccharide in in fermented mycelia

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