侯平，楊麗，劉寧，陳磊

（1.遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院心內(nèi)二科，沈陽 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院藥理學教研室，沈陽 110847；3.中國醫(yī)科大學藥學院藥理學教研室，沈陽 110001）

《傷寒論》第301條“少陰病，始得之，反發(fā)熱，脈沉者，麻黃細辛附子湯主之”主張心動過緩癥以麻黃細辛附子湯治療。大量臨床觀察證明麻黃細辛附子湯對慢性心動過緩癥狀有改善作用［1～3］，但其配伍的現(xiàn)代醫(yī)學作用機制尚不明確?？剐穆墒СＫ幬锏幕倦娚碜饔檬怯绊懶募〖毎さ碾x子通道，通過改變離子流而改變細胞的電生理特性。因此本研究通過考察麻黃細辛附子的3種活性單體麻黃堿、β-細辛醚和去甲烏藥堿對大鼠心室肌細胞內(nèi)鈣離子濃度和高電壓依賴性鈣通道電流的影響，從中藥有效單體對鈣離子流影響的角度闡明麻黃細辛附子配伍的合理性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

健康大鼠由遼寧中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供［合格證號為SCXK（遼）2010-0001］，體質(zhì)量250～300 g，雌雄不拘。所有實驗動物操作均符合遼寧中醫(yī)藥大學動物保護條例。主要試劑有麻黃堿（南京澤朗醫(yī)藥科技公司，98.0%）、β-細辛醚（Sigma，批號03124JRV，70%）、去甲烏藥堿（南京澤朗醫(yī)藥科技公司，98.0%）、膠原酶V（美國Sigma公司）。

1.2 儀器

激光掃描共聚焦顯微鏡（FV1000S-SIM/IX81，日本 OLYMPUS 公 司 ）、P-97 Flaming/Brown Micropipetter Puller（美國Sutter instrument公司）、MultiClamp700B（美國Axon公司）、pClamp10.0數(shù)據(jù)分析軟件（美國Axon公司）、玻璃電極拋光器（MF-9，Narishige會社）、CF7D2型離心機（Hitachi Himac會社）等。

1.3 急性心室肌細胞的單離

正 常 臺 氏 液 （mmol/L）：NaCl 143，KCl 5.4，NaH2PO40.30，HEPES 5，葡萄糖 5.5，MgCl20.5，CaCl21.8，以NaOH調(diào)pH 7.4。低鈣臺氏液：鈣離子濃度為 20～70 μmol/L 的臺式液。Kraftbrune（KB）液（mmol/L）：KOH 70，谷氨酸 50，KCl 40，KH2PO420，牛磺酸 20，MgCl23，葡萄糖 10，HEPES 10，EGTA 0.5，以HCl調(diào)pH 7.4。動物麻醉后迅速開胸取出心臟，置于4℃預冷0.9%氯化鈉注射液中沖洗，剪開心包，經(jīng)主動脈插管懸掛于改良的Langendorff灌流裝置上，依次用正常臺氏液、低鈣臺氏液經(jīng)主動脈根部逆行灌流，當心臟跳動完全停止時，改用含膠原酶V（0.3 mg/mL）的臺氏液消化20～30 min，再以KB液灌流，除去膠原酶后，將心室取下在KB中緩慢吹打分離，過濾離心后，將心室肌細胞置于KB液中穩(wěn)定冷藏保存，4～8 h內(nèi)使用。整個灌流系統(tǒng)溫度保持在37℃，所有液體均用氧氣飽和。

1.4 細胞內(nèi)鈣離子濃度變化的測定［4］

1.4.1 熒光探針標記：將急性單離心室肌細胞接種于經(jīng)0.01%多聚賴氨酸包被的激光共聚焦測鈣專用NEST細胞培養(yǎng)皿上靜止30 min。待細胞完全貼壁后移去培養(yǎng)皿內(nèi)液體，將198 μL正常臺氏液和2 μLCa2+熒光探針染料Fluo-3/AM（終濃度為5μmol/L）混勻后加入培養(yǎng)皿小室中，37℃孵箱避光孵育45 min，使Fluo-3/AM與鈣離子充分結(jié)合。測定前用正常臺氏液清洗3次，加入200 μL含鈣或無鈣臺氏液待測。將培養(yǎng)皿置于激光掃描共聚焦顯微鏡載物臺上，在光鏡下找到形態(tài)完整、橫紋清晰的細胞，對其進行掃描（頻率為0.2 Hz）。

1.4.2 鈣離子濃度變化測定：Fluo-3/AM被動擴散進入細胞后，被酯酶水解釋出Fluo-3，F(xiàn)luo-3與Ca2+絡合，在488 nm處的激光激發(fā)而產(chǎn)生熒光，其熒光值與鈣離子濃度呈正相關，即以熒光值變化表示鈣離子濃度變化，以平均熒光強度代表鈣離子濃度。激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長526 nm。先測定靜息狀態(tài)下給藥前鈣離子濃度作為對照，再加入相應濃度的試藥麻黃堿、β-細辛醚或去甲烏藥堿，觀察細胞內(nèi)鈣離子濃度的動態(tài)變化情況，測定給藥后鈣離子濃度。

1.5 膜片鉗全細胞記錄技術

根據(jù)Hamill等［5］方法進行全細胞膜片鉗記錄實驗。吸幾滴細胞懸液加入細胞池中，置于倒置顯微鏡（IMT-2，Olympus）工作臺上，放置 10 min 左右，待細胞貼壁后用臺氏液持續(xù)灌流，流速為3 mL/min，溫度保持在（25±2）℃，選擇表面光潔、橫紋清楚的細胞作為實驗對象，將玻璃電極輕壓在細胞表面，用負壓使電極尖端與細胞膜表面形成GΩ高阻封接后，再以較大負壓吸破細胞膜，補償電容電流及電極串聯(lián)電阻，形成全細胞記錄。記錄信號經(jīng)Ag-AgCl電極引導，電流經(jīng)放大器（MultiClamp 700B）放大，再經(jīng)Digidata 1440進行A-D轉(zhuǎn)換采集數(shù)據(jù)，由pClamp10.0軟件處理和分析。用P-97電極拉制器將玻璃微電極拉制后，經(jīng)拋光器拋光，充灌電極內(nèi)液后尖端阻抗為5～10 MΩ。電極內(nèi)液組成為（mmol/L）CsCl 130，HEPES 5，MgCl21，K2ATP 5，CPK 5，EGTA 1，CsOH調(diào)pH至7.2。細胞外灌流液為正常臺氏液。

1.6 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)經(jīng)Clamp10.0系統(tǒng)處理，經(jīng)SPSS 15.0軟件統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，兩組間差異比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 麻黃堿、β-細辛醚和去甲烏藥堿對細胞內(nèi)鈣離子濃度的影響

經(jīng)初步量效關系篩查，確定濃度為2 μmol/L的麻黃堿、β-細辛醚和去甲烏藥堿對心肌細胞內(nèi)鈣離子濃度有顯著影響且沒有毒性作用，因此本研究中統(tǒng)一使用此濃度。Fluo-3/AM熒光探針法細胞內(nèi)鈣測定結(jié)果表明，2 μmol/L麻黃堿可使單離大鼠心肌細胞鈣離子濃度顯著升高至（122.99±6.93）%，與給藥前（100%）比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。而 2 μmol/L β-細辛醚和 2 μmol/L 去甲烏藥堿則使鈣離子濃度下降，分別為（83.38±1.30）%和（89.83±2.11）%，與給藥前比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。

為了明確麻黃堿對鈣離子濃度的升高作用是否與細胞外鈣離子通過鈣通道內(nèi)流有關，采用細胞外液鈣離子濃度為零溶液測定鈣離子濃度。此時若麻黃堿給藥后的鈣離子濃度升高作用受到抑制，則表明該作用與細胞外鈣離子內(nèi)流有關。實驗表明，在細胞外鈣離子濃度為零的條件下，與給藥前比較，2 μmol/L麻黃堿沒有使鈣離子濃度顯著升高（103.33±2.19%），說明麻黃堿的升高鈣離子濃度作用與促進細胞外鈣離子通過鈣離子通道內(nèi)流有關。

2.2 麻黃堿、β細辛醚和去甲烏藥堿對高電壓依賴性鈣離子通道電流的影響

為了確定高電壓依賴性鈣離子通道在3種單體對鈣離子流動影響中的貢獻，采用全細胞電壓鉗法測定心肌細胞高電壓依賴性鈣離子通道的鈣電流（ICa）。設定保持電位-40 mV，指令電壓為-50～+50 mV，步階電壓10 mV，刺激頻率為2 Hz，刺激間隔為6 s，記錄ICa。為消除細胞間誤差，電流值以電流密度（pA/pF）表示。與給藥前比較，2 μmol/L麻黃堿顯著提高了心肌細胞ICa峰電流密度值（P<0.05），見圖1、表 1；而 2 μmol/L β-細辛醚和 2 μmol/L 去甲烏藥堿給藥后分別與給藥前比較略有下降，但差異沒有統(tǒng)計學意義（表1）。

表1 2 μmol/L麻黃堿、β-細辛醚和去甲烏藥堿給藥前后ICa峰電流密度變化比較Tab.1 Changes of peak current density ICabefore and after administration of 2 μmol/L ephedrine，β-asarone and higenamine

3 討論

中藥麻黃的有效成分麻黃堿是一種腎上腺素能受體激動劑，既能促進去甲腎上腺素神經(jīng)末梢釋放去甲腎上腺素，又能直接作用于腎上腺素受體發(fā)揮擬腎上腺素作用。麻黃堿可激動β1受體使心肌收縮力增強，心輸出量增加，心率加快。本研究初步篩查了麻黃堿、β-細辛醚和去甲烏藥堿分別對心肌細胞鈣離子流的影響，結(jié)果表明麻黃堿可使通過高電壓依賴性鈣通道電流密度增加，與鈣離子濃度變化呈相同趨勢，說明麻黃堿對鈣離子流動的影響在于促進細胞膜電壓依賴性的鈣通道開放，鈣離子大量流入細胞內(nèi)，從而使鈣離子濃度升高，可興奮心肌細胞，但也可能造成心肌細胞過度興奮而導致心律失常。

β-細辛醚使通過高電壓依賴性鈣通道的電流密度稍有減弱，使細胞內(nèi)鈣離子濃度顯著下降，與其在皮質(zhì)神經(jīng)元細胞的作用基本相同［6］，表明β-細辛醚有一定的鈣通道阻滯作用而使冠脈血管擴張［7］。研究證明去甲烏藥堿能輕微上調(diào)β-腎上腺素受體［8］，提高竇房結(jié)自律性和改善房室傳導，具有強心和提高心率作用［9］。因此，β-細辛醚與去甲烏藥堿有改善心肌血供和增加心輸出量的作用。同時，本研究發(fā)現(xiàn)β-細辛醚和去甲烏藥堿均輕微降低鈣內(nèi)流，減輕細胞內(nèi)鈣超載，此結(jié)果進一步證實β-細辛醚和去甲烏藥堿可對受損傷的心肌細胞有保護作用［10，11］。

綜上所述，麻黃細辛附子三味中藥的活性單體中，麻黃堿能升高細胞內(nèi)鈣離子濃度和促進高電壓依賴性鈣離子內(nèi)流，對心肌細胞有興奮作用；β-細辛醚、去甲烏藥堿能降低細胞內(nèi)鈣離子濃度，使心肌細胞免受鈣超載損傷而具有保護作用。3種單體對心肌細胞鈣離子影響作用可相互補償控制，符合中藥方劑學相反相成配伍理論，提示麻黃細辛附子湯既有興奮心肌細胞的作用成分又有可控制由心肌細胞興奮所產(chǎn)生的心律失常的成分，可能因此具有綜合調(diào)控心率的作用。3種單體對心肌細胞功能影響的直接相互作用關系及其機制將進一步研究。

［1］魯麗.麻黃附子細辛湯加味治療病竇心動過緩的臨床經(jīng)驗［J］.中國中醫(yī)藥雜志，2008，6（7）：43-44.

［2］劉小鋒，李登科.麻黃附子細辛湯加味治療病竇綜合征致緩慢性心律失常 41 例［J］.陜西中醫(yī)，2008，29（7）：842.

［3］宋菊芯.麻黃附子細辛湯加味治療緩慢性心律失常36例［J］.中國中醫(yī)急癥，2011，20（3）：475.

［4］丁炎，那存烏力吉，閆雪晶，等.不同糖濃度中大鼠DRG神經(jīng)元相關蛋白表達及Ca2+濃度的測定［J］.中國醫(yī)科大學學報，2012，41（12）：1095-1098.

［5］Hamill OP，Marty A，Neher E，et al.Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free memebrane patches［J］.Pflugers Arch，1981，391（2）：85-100.

［6］江湧，何玉萍，鄒衍衍，等.β-細辛醚對癡呆小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細胞內(nèi)鈣離子濃度的影響［J］.中國康復醫(yī)學雜志，2007，22（6）：490-491.

［7］杜毅，陳瑞軍，趙麗蓉.石菖蒲的化學與藥理研究新進展［J］.山西中醫(yī)，2000，16（1）：53-54.

［8］向榮，徐江濤.去甲烏藥堿的藥理作用與心臟β-AR關系的初步研究［J］.中國藥理學通報，1995，11（2）：113-116.

［9］田銳，王蒨，米宏志，等.鹽酸去甲烏藥堿注射液在藥物負荷核素心肌灌注顯像中的有效性與安全性［J］，中國臨床藥理學雜志，2012，28（2）：88-90.

［10］王綺雯，吳啟端，陳奕芝.β-細辛醚對缺血/再灌注損傷心肌細胞的保護作用［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2008，15（12）：44-46.

［11］王綺雯，吳啟端，陳奕芝.β-細辛醚對缺血/再灌注損傷心肌細胞線粒體膜電位的影響［J］.中藥新藥與臨床藥理，2008，19（6）：451-454.