劉書源，劉雅茹，高青華，趙美瞇，趙金生，孫雪菲，郝麗英

（中國醫(yī)科大學1.藥學院藥物毒理教研室；2.生物制藥研究室，沈陽 110001）

L-型鈣通道普遍存在于機體的各種組織和細胞中，尤其是骨骼肌和心?。?，2］，L-型鈣通道在生理功能的調(diào)節(jié)方面起到了重要作用，鈣離子通過L-型鈣通道進入細胞后［3］，可引起肌細胞興奮和收縮［4］，調(diào)控腺體分泌激素和調(diào)節(jié)基因的表達［5］。因此對L-型鈣通道的研究一直是多個學科領(lǐng)域的研究熱點。膜片鉗技術(shù)是研究離子通道的主要技術(shù)，共有4種基本記錄模式。由于L-型鈣通道電導(dǎo)小，大多實驗室都采用全細胞記錄模式研究整個細胞中L-型鈣通道的作用，但是單通道記錄模式可以使我們了解到L-型鈣通道的門控機制、通道性質(zhì)與結(jié)構(gòu)關(guān)系、細胞內(nèi)通道信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程等，其中細胞貼附式記錄模式可用于檢測離子通道的特性，內(nèi)膜外記錄模式可以便于更換細胞內(nèi)液，適于研究離子通道的細胞內(nèi)成分的效應(yīng)［6］。所以確立穩(wěn)定的心室肌細胞的膜片鉗單通道的記錄模式尤為重要。本研究在以往研究的基礎(chǔ)上，對記錄單通道鈣電流的實驗方法進行改進，記錄到大鼠心室肌細胞膜上的單通道鈣電流，并分析L-型鈣通道的基本特性，為研究離子通道的細胞內(nèi)成分效應(yīng)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Wistar大鼠（250～350 g），雌雄不限，由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.2 溶液與藥品

無鈣臺氏液（mmol/L）：NaCl 135，KCl 5.4，MgCl21.0，NaH2PO40.33，Glucose 5，CaCl21.8，和 Hepes 10（pH 7.4）；保存液（KB 液）（mmol/L）：KOH 70，Glutamic acid 50，KCl 40，KH2PO420，Taurine 20，MgCl23，Glucose 10，EGTA 0.5，Hepes 10（pH 7.4）；電極內(nèi)液 （mmol/L）：BaCl250，TEACl 70，EGTA 0.5，Bay K8644 0.03和 Hepes 10（pH 7.4）；IO 液（mmol/L）：Aspartic acid 130，KOH 100，KCl 30，MgCl20.5，EGTA 1，CaCl20.5，HEPES 10（pH 7.4）。NaCl，KCl，MgCl2，NaH2PO4，NaOH，KOH，KH2PO4，Glucose 和 Taurine均為國產(chǎn)市售分析純試劑；Aspartic acid，Glutamic acid和HEPES購自Amresco公司；EGTA購自日本DOJINDO公司；Protease和Bay K8644購自Sigma公司；膠原酶I型購自Worthington biochemical corporation。

1.3 單個大鼠心室肌細胞的制備

采用酶機械法分離心室肌細胞［7］，戊巴比妥鈉100 mg/kg腹腔注射麻醉，在人工呼吸機的支持下進行主動脈逆行插管。游離出心臟后置于Langendorff灌流裝置，進行主動脈灌流。先用臺氏液灌流約3 min，繼以無鈣臺氏液灌流約6 min，然后用含膠原酶［濃度為（0.22～0.24 mg/mL）］的無鈣臺氏液消化 20～30 min，最后用KB液沖洗殘酶約5 min。整個灌流系統(tǒng)所用液體均用恒溫水浴保持在37℃，所有液體均用純氧飽和。灌流結(jié)束后，取下左心室，放入室溫的KB液中機械分離細胞，得到單個細胞懸液。將得到的細胞懸液經(jīng)鋼絲膜濾過后，置于含蛋白酶的KB液中，37℃水浴均勻震蕩4 min。離心3次（1 000 r/min，3 min），棄去上清后，將細胞置于4℃冰箱穩(wěn)定1 h后進行實驗。

1.4 單通道膜片鉗技術(shù)記錄L-型鈣通道電流

應(yīng)用膜片鉗放大器利用細胞貼附式和內(nèi)膜向外式膜片鉗技術(shù)進行單通道電流記錄。兩步拉制法拉制電極，電極尖端表面涂以硅酮樹脂，然后烘干。電極內(nèi)液中加入 50 mmol/L Ba2+和 30 μmol/L Bay K8644，Bay K8644為L-型鈣通道的激動劑，它能夠延長鈣通道的開放時間，不影響電流的大?。?］。灌流液為IO液。利用Ba2+負載記錄細胞膜上L-型鈣通道電流，通過鈣通道的鋇電流由從-70 mV至0 mV的去極化脈沖引出，波寬200 ms，刺激頻率0.5 Hz，由Axopatch 200B膜片鉗放大器（美國Axon公司）放大，通過Digidata 1440數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器（美國Axon公司），由計算機pClamp10軟件采集，采樣速率為3.3 Hz。并用pClamp10分析軟件進行分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠心室肌細胞的制備

本實驗得到單個心室肌細胞存活率達40%～50%，×400鏡下可見活細胞形態(tài)良好，呈桿狀或柱狀，具有清晰的橫紋（圖1）。

2.2 單通道膜片鉗技術(shù)記錄L-型鈣通道電流及其數(shù)據(jù)分析

2.2.1 記錄L-型鈣通道的單通道電流：形成細胞貼附式記錄模式后，在電壓鉗狀態(tài)下，膜電位由保持電位-70 mV去極化至0 mV，刺激時間200 ms，記錄到L-型鈣通道的單通道電流圖（圖2），最下面一條曲線為上面20條曲線的平均值。

2.2.2 L-型鈣通道單通道電流幅度分析：記錄到L-型鈣通道單通道電流后，用Clampfit分析軟件作出電流幅度直方圖，采用高斯方程進行擬合后，其峰值就是單通道開放的平均電流幅度。圖3為實驗中一實例，通過擬合后得到電流的平均幅度為1.13 pA。

2.2.3 L-型鈣通道的開關(guān)動力學分析：記錄到L-型鈣通道單通道電流后，用Clampfit分析軟件作出通道開關(guān)時間的事件頻數(shù)直方圖，然后選擇指數(shù)方程對其擬合，求出通道開放和關(guān)閉時間分布的時間常數(shù)τ值。Bay K8644為L-型鈣通道激動劑，它能夠延長鈣通道的開放時間，但不影響電流的大小，所以本實驗分別計算電極內(nèi)液中加入 30 μmol/L Bay K8644和未加入Bay K8644時通道開放和關(guān)閉時間分布的時間常數(shù)τ值。電極內(nèi)液中加入30 μmol/L Bay K8644時，通道開放時間的τo為14.8 ms（圖4 A），關(guān)閉時間的 τc為 20.04 ms（圖 4 C）；電極內(nèi)液中未加入30 μmol/L Bay K8644時，通道開放時間的τo為1.35 ms（圖4 B），通道關(guān)閉時間τc為46.75 ms（圖4 D）。

2.2.4 L-型鈣通道的電導(dǎo)：在電壓鉗狀態(tài)下，以10 mV步階電壓使心肌細胞膜的膜電位由-20 mV逐步去極化到+20 mV，刺激電壓持續(xù)200 ms，保持電位-70 mV，記錄到-20 mV，-10 mV，0 mV，10 mV，20 mV膜電位下的一系列電流（圖5 A）。對不同膜電位下記錄到的電流進行電流幅度直方圖擬合，求出各個電壓下的平均電流幅度值，膜電位為-20 mV（8例）的平均電流幅度為（-1.59±0.01）pA，膜電位為-10 mV（9例）的平均電流幅度為（-1.42±0.06）pA，膜電位為0 mV（13例）的平均電流幅度為（-1.16±0.06）pA，膜電位為 10 mV（12例）的平均電流幅度為（-1.02±0.05）pA，膜電位為 20 mV（6例）的平均電流幅度為（-0.84±0.11）pA，最后作出I-V曲線（圖5 B），進而求得斜率電導(dǎo)，本實驗條件下求出的斜率電導(dǎo)為19 pS。

2.2.5 L-型鈣通道的Run-down現(xiàn)象：采用內(nèi)膜向外膜式記錄L-型鈣通道電流時，以基本細胞內(nèi)液灌流膜片，通道的活性會迅速減弱直至完全消失，這種現(xiàn)象被稱為Run-down。圖6表示的是在細胞貼附模式下記錄鈣通道電流2 min后，再形成膜內(nèi)向外膜片記錄方式所得到的通道開放概率圖，從圖6中可以看出采用內(nèi)膜向外記錄模式后鈣通道NPo迅速降低的現(xiàn)象。

3討論

心肌細胞的分離是重要基礎(chǔ)，膜片鉗實驗要求細胞標本具有呼吸活性、細胞膜完整、平滑、清潔度高，以利于微電極與細胞膜進行高阻封接。本實驗中我們總結(jié)影響細胞產(chǎn)量和質(zhì)量的關(guān)鍵因素如下：（1）手術(shù)：采用在體游離心臟，進行主動脈逆行插管，配合人工呼吸機，可避免手術(shù)中心肌細胞缺血缺氧，其中難點為主動脈插管深度把握。灌流液的溫度一般在（35～37）℃，pH值要保持在 7.4，可以略微偏酸。另外，實驗中所用灌流液均用Milli-Q水配制，其電阻值≥18 MΩ。整個灌流系統(tǒng)要排盡氣泡，避免空氣栓塞導(dǎo)致局部冠脈不通，灌流液需要通氧氣飽和，以減輕灌流消化過程中引起的細胞缺氧甚至死亡［7］。（2）膠原酶的用量及時間：酶量過多會使細胞本身的結(jié)構(gòu)遭到破壞，得到的細胞體積膨大，結(jié)構(gòu)模糊，橫紋消失。酶量過少，細胞間的連接未被消化，在吹打時，剪下的小塊心肌組織不易分散呈絮狀，用力吹打，則細胞碎片較多，死細胞多，而長桿狀結(jié)構(gòu)清晰的活細胞幾乎沒有。膠原酶的灌流時間是最大的難點和重點，實驗時要根據(jù)大鼠個體的體質(zhì)量和灌流液流速適當?shù)匮娱L或縮短消化時間［9，10］。（3）分離得到的細胞放在KB液里保存，這種高鉀低鈉的溶液可以顯著延長細胞保存時間，改善細胞狀態(tài)［11］。

L-型鈣電流為小電導(dǎo)電流，電流幅度小，極易被埋沒在噪音里，因此本實驗的難點就是對整個膜片鉗系統(tǒng)裝置噪音的排除，包括膜片鉗放大器、探頭、電極夾持器、電極及浴槽等處的噪音。降低膜片鉗系統(tǒng)裝置的噪音，可通過接地屏蔽等方法［6］。在電極尖端玻璃外壁涂上疏水性樹脂，可以降低電極噪音，涂抹時要盡可能靠近電極尖端，涂抹厚度要盡可能的厚［12］，另外良好的高阻封接是獲得低噪聲記錄的先決條件，電阻值愈大，噪聲電流愈?。?］。另外，在細胞懸液中加入微量蛋白酶，有利于膜片鉗實驗中電極與細胞膜之間進行高阻封接［13］。

我們在實驗中發(fā)現(xiàn)，在正常生理條件下記錄到的單通道L-型鈣電流的平均開放時間非常短暫，對觀察實驗現(xiàn)象和后期比較實驗數(shù)據(jù)不利，因此我們采用在電極內(nèi)液中加入Bay K8644的方法，使L-型鈣電流的平均開放時間明顯增加，且對L-型鈣電流的大小無影響［8］，有利于實驗觀察與數(shù)據(jù)分析。

本實驗建立的大鼠心室肌細胞適用于膜片鉗單通道記錄模式，成功記錄到了大鼠心室肌細胞膜上的單通道鈣電流，分析其電生理學性質(zhì)，其結(jié)果符合L-型鈣通道電流性質(zhì)，為應(yīng)用膜片鉗技術(shù)研究離子通道的細胞內(nèi)成分的作用提供依據(jù)。

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