王立江，蔣玥

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林吉林 132101）

長(zhǎng)白山野菊花（Chrysanthemum indicum L.flowers），是生長(zhǎng)于長(zhǎng)白山地帶的一種天然菊科植物，有藥用作用的部分是其干燥的頭狀花序[1]，又名為“瘧疾草”、“山菊花”、“苦薏”等。野菊花在我國(guó)民間藥用歷史悠久，始載于唐《本草拾遺》；《名醫(yī)別錄》中記載其“苦、辛、微寒”，具有“清熱解毒、平肝”具有清熱解毒、平肝的功效[2]?，F(xiàn)代研究得到野菊花具有廣譜抗菌[3]、抗病毒的功效，還有消炎[4]、抗癌的功效；野菊花中富含黃酮類化合物、萜類、揮發(fā)油[5]、多種有機(jī)酸（包括：綠原酸、棕櫚酸等）。野菊花尚含有山蓊酸甘油酯，還有葉綠素、維生素及硒、鎳、錳等多種微量元素和膽堿、水蘇堿、嘌呤、鞣質(zhì)等。臨床上利用野菊花治療慢性盆腔炎，宮頸糜爛，慢性前列腺炎均有顯著功效。野菊花中類黃酮是野菊花各種藥理作用的主要成分。類黃酮可以抑制脂質(zhì)氧化[6]，血小板凝集從而降血壓、清除活性氧自由基[7]；其舒張血管的作用可以增加冠脈血流量，改善毛細(xì)管的通透性及脆性。目前臨床還會(huì)用于治療病毒性肝炎、前列腺炎、慢性咽炎等各種炎癥及病毒性疾病、心血管疾病、高血壓、傳染性軟疣及癌癥。

微波提取法是利用微波能來(lái)提高提取速率的一種最新發(fā)展起來(lái)的技術(shù)，具有快速、節(jié)能、得率高的優(yōu)點(diǎn)[8]。微波提取法在我國(guó)的中藥檢測(cè)、環(huán)境保護(hù)測(cè)定、天然香精香料開(kāi)發(fā)、食品分析、化妝品[9]等領(lǐng)域日益受到重視。1992年陸續(xù)在美國(guó)、墨西哥、日本、西歐、韓國(guó)被廣泛應(yīng)用，在薄荷、海藻中提取有效物質(zhì)均獲得成功。目前微波提取技術(shù)主要有三種：直接采用家電型微波爐對(duì)原材料處理進(jìn)行試驗(yàn)；自制的具有壓力和溫度控制的微波提取設(shè)備；專門(mén)制造的微波提取系統(tǒng)[10]。

微波提取技術(shù)的特點(diǎn)：微波加熱屬于“體積加熱”，加熱迅速且加熱均勻性好，熱量直接作用于介質(zhì)分子，使物料整體同時(shí)被加熱。選擇性加熱[11]，可提高提取效率以達(dá)到更好的提取效果，節(jié)省原料的消耗。熱量損失少，效率高，高效節(jié)能并且易于控制。整個(gè)過(guò)程不產(chǎn)生余熱和粉塵、無(wú)有害氣體排放，安全環(huán)保[12]。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

長(zhǎng)白山野菊花：采摘于長(zhǎng)白山脈；AL204型電子天平：上海速展計(jì)量?jī)x器有限公司；g80f23cn2l-a9（so）格蘭仕微波爐：廣東格蘭仕集團(tuán)有限公司；JH-210K宇普食品加工機(jī)：慈溪鳴威電子商務(wù)有限公司；TDL-4型臺(tái)式離心機(jī)：上海嘉鵬科技有限公司；UV-1700型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)：上海將來(lái)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；移液器：市售。

1.2 方法

1.2.1 提取工藝

將長(zhǎng)白山野菊花風(fēng)干至恒重后，用食品加工機(jī)研磨成細(xì)分，采用AL204型電子天平稱取1 g粉末裝于250 mL的錐形瓶中備用。將錐形瓶中加入定量的蒸餾水后[13]，在微波爐中加熱一定時(shí)間后，取出加入一定量的乙醇，采用回流提取，提取溫度為70℃、時(shí)間2 h。將提取液用濾紙過(guò)濾后，取適量提取液采用TDL-4型臺(tái)式離心機(jī)將提取液離心后待測(cè)定。

1.2.2 類黃酮含量測(cè)定

取離心后的提取液1 mL于25 mL容量瓶中，用甲醇（分析純）定容至25 mL后，靜置2 min，加入到洗凈擦干的比色皿中，用UV-1700型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，采用波長(zhǎng)為360 nm的紫外光，測(cè)定提取液的吸光度。根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線可以直接得到類黃酮濃度，再根據(jù)定容的體積可求得類黃酮含量。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of the rutin standard samples

1.2.3 單因素試驗(yàn)

在提取過(guò)程中選取微波處理強(qiáng)度、微波處理時(shí)間、提取液濃度及料液比4個(gè)可能影響類黃酮提取效果的因素分別做單因素試驗(yàn)。將提取液以“1.2.2”方法測(cè)定吸光值，以圖1標(biāo)準(zhǔn)曲線求得類黃酮得率，以其為考察指標(biāo)，確定選取各因素的合適范圍。

1.2.3.1 以微波強(qiáng)度為研究因素

稱取1 g長(zhǎng)白山野菊花粉末，裝于250 mL的錐形瓶中，以 1∶20（g∶mL）的料液比加入蒸餾水，分別選取0、300、600、900、1 200 W 5 組不同的微波處理強(qiáng)度，將野菊花料液處理4 min，加入濃度為70%乙醇20 mL，以提取溫度為70℃、時(shí)間2 h進(jìn)行回流提取。取離心分離后的提取液1 mL于25 mL容量瓶中，用甲醇（分析純）定容至25 mL，靜置2 min，用UV-1700型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，采用波長(zhǎng)為360 nm的紫外光，測(cè)定提取液的吸光度。根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線可以直接得到類黃酮濃度，再根據(jù)定容的體積可求得類黃酮含量。

1.2.3.2 以微波處理時(shí)間為研究因素

稱取1 g長(zhǎng)白山野菊花粉末，裝于250 mL的錐形瓶中，以 1 ∶20（g∶mL）的料液比加入蒸餾水，在 600 W的微波強(qiáng)度下，分別處理 2、3、4、5、6 min 后，加入濃度為70%的乙醇20 mL，提取溫度為70℃、時(shí)間2 h進(jìn)行回流提取。取離心分離后的提取液1 mL于25 mL容量瓶中，用甲醇（分析純）定容至25 mL，靜置2 min，用UV-1700型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，采用波長(zhǎng)為360nm的紫外光，測(cè)定提取液的吸光度。根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線可以直接得到類黃酮濃度，再根據(jù)定容的體積可求得類黃酮含量。

Let Eqs. (6) – (5), finally we get the output resistance:

1.2.3.3 以提取液濃度為研究因素

稱取1 g長(zhǎng)白山野菊花粉末，裝于250 mL的錐形瓶中，以 1 ∶20（g∶mL）的料液比加入蒸餾水，在 600 W的微波強(qiáng)度下處理4 min，分別加入20 mL濃度為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，在70℃下回流提取2 h。取離心分離后的提取液1 mL于25 mL容量瓶中，用甲醇（分析純）定容至25 mL，靜置2 min，用UV-1700型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，采用波長(zhǎng)為360nm的紫外光，測(cè)定提取液的吸光度。根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線可以直接得到類黃酮濃度，再根據(jù)定容的體積可求得類黃酮含量。

1.2.3.4 以提取液料液比為研究因素

稱取1 g長(zhǎng)白山野菊花粉末，裝于250 mL的錐形瓶中，加入料液比分別為 1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30[14]的蒸餾水（g∶mL），在 600 W 的微波強(qiáng)度下將野菊花料液處理4min，加入濃度為70%的乙醇20mL，在70℃下回流提取2 h。取離心分離后的提取液1 mL于25 mL容量瓶中，用甲醇（分析純）定容至25 mL，靜置2 min，用UV-1700型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，采用波長(zhǎng)為360 nm的紫外光，測(cè)定提取液的吸光度。根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線可以直接得到類黃酮濃度，再根據(jù)定容的體積可求得類黃酮含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳微波強(qiáng)度的確定

準(zhǔn)確稱取1g長(zhǎng)白山野菊花粉末，以1∶20（g∶mL）的料液比加入蒸餾水，分別選取0、300、600、900、1200W 5組不同的微波處理強(qiáng)度，將野菊花料液處理4 min，取出后加入濃度為70%的乙醇20 mL，在70℃下回流提取2 h后，濾液采用1.2.2的方法測(cè)得類黃酮的含量，得到圖2，即為不同微波強(qiáng)度處理后的結(jié)果：

圖2 微波處理強(qiáng)度對(duì)類黃酮得率的影響Fig.2 Influence of micro-wave treatment power on flavonoid extraction yield

從圖2可以看出，提取液中類黃酮的含量在一定范圍內(nèi)會(huì)隨著微波強(qiáng)度的增加而上升。當(dāng)微波強(qiáng)度由0上升到600 W時(shí)，得率逐漸上升；達(dá)到600 W時(shí)，提取類黃酮含量最高。隨后隨著微波強(qiáng)度的上升，類黃酮得率開(kāi)始下降?？赡苡捎谖⒉ㄌ幚砑夹g(shù)是將微波電磁能轉(zhuǎn)化成熱能，利用微波受熱均勻的特點(diǎn)，輔助提取，從而提高類黃酮得率。但是當(dāng)微波強(qiáng)度過(guò)高時(shí)，細(xì)胞受熱溫度升高過(guò)快、達(dá)到的溫度過(guò)高且容易使溶液暴沸導(dǎo)致溶液溢出或者容器內(nèi)溶液蒸干，都會(huì)影響類黃酮得率。從而使提取液中類黃酮含量下降。所以適宜的微波處理強(qiáng)度為600 W。

2.2 最佳微波處理時(shí)間的確定

準(zhǔn)確稱取1 g長(zhǎng)白山野菊花粉末，以1∶20（g∶mL）的料液比加入蒸餾水，將料液在600 W的微波強(qiáng)度下，分別選取 2、3、4、5、6 min 5個(gè)水平的處理時(shí)間處理，取出后加入濃度為70%的乙醇20 mL，在70℃下回流提取2 h后，濾液采用1.2.2的方法測(cè)得類黃酮的含量，得到圖3，即為不同微波處理時(shí)間對(duì)類黃酮得率的影響結(jié)果。

從圖3可以看出，微波處理時(shí)間對(duì)長(zhǎng)白山野菊花中類黃酮的得率的影響也至關(guān)重要，微波處理的穿透力強(qiáng)，在短時(shí)間內(nèi)便可以讓料液中的極性分子吸收大量的熱量，使類黃酮得率在短時(shí)間內(nèi)提高。在操作中微波處理時(shí)間過(guò)短，達(dá)不到微波處理的目的，提高得率的效果不明顯；當(dāng)時(shí)間達(dá)到4 min時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)。采用更長(zhǎng)時(shí)間處理野菊花，由于長(zhǎng)時(shí)間的微波作用，微波的強(qiáng)熱效應(yīng)使野菊花加熱過(guò)度，組織中的類黃酮被破壞分解，同時(shí)蛋白質(zhì)發(fā)生變性，阻擋類黃酮的溶出以及加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，水分過(guò)分蒸發(fā)，導(dǎo)致類黃酮溶出減少，反而使類黃酮得率開(kāi)始緩慢下降，所以適宜的微波處理時(shí)間為4 min。

圖3 微波處理時(shí)間對(duì)類黃酮得率的影響Fig.3 Influence of micro-wave treatment temperature on flavonoid extraction yield

2.3 最佳提取液（乙醇）濃度的確定

準(zhǔn)確稱取1 g長(zhǎng)白山野菊花粉末，以1∶20（g∶mL）的料液比加入蒸餾水，將料液在600 W的微波強(qiáng)度下處理4 min，取出后分別選取乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%體積分?jǐn)?shù)為測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)，分別取20 mL加入，在70℃下回流提取2 h后，濾液采用1.2.2的方法測(cè)得類黃酮的含量，得到圖4，即為不同提取液（乙醇）濃度對(duì)類黃酮得率的影響結(jié)果：

圖4 乙醇濃度對(duì)類黃酮得率的影響Fig.4 Influence of ethanol concentration on flavonoid extraction yield

從圖4可以看出提取液乙醇的濃度對(duì)類黃酮得率影響較大，在體積分?jǐn)?shù)小于70%的濃度標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，類黃酮得率隨著乙醇濃度上升，當(dāng)濃度大于70%的濃度標(biāo)準(zhǔn)后，再提高乙醇溶液的濃度，類黃酮得率急劇下降。在提取類黃酮的過(guò)程中，乙醇作為一種提取劑，將類黃酮溶入。當(dāng)乙醇濃度較小時(shí)，溶出的糖類、水溶性蛋白質(zhì)等因提取液含水量較多而溶出較多，類黃酮得率較少，當(dāng)濃度達(dá)到70%的濃度標(biāo)準(zhǔn)時(shí)類黃酮得率達(dá)到最高；但隨著乙醇濃度的升高，酒精濃度過(guò)高會(huì)使葉綠素等物質(zhì)溶出，影響類黃酮的溶出而使得率下降，所以適宜的乙醇濃度為70%的濃度標(biāo)準(zhǔn)。

2.4 最佳料液比的確定

準(zhǔn)確稱取1 g長(zhǎng)白山野菊花粉末，分別以1∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g∶mL）的料液比加入蒸餾水單位，將料液在600 W的微波強(qiáng)度下處理4 min，取出后加入濃度為70%的乙醇20mL，在70℃下回流提取2 h后，濾液采用1.2.2的方法測(cè)得類黃酮的含量，得到圖5，即為不同提料液比對(duì)類黃酮得率的影響結(jié)果。

圖5 料液比對(duì)類黃酮得率的影響Fig.5 Influence of ratio of solid to liquid on flavonoid extraction yield

從圖5可以看出，類黃酮的得率隨著料液比的增加先上升后下降。料液比越大，溶質(zhì)與溶劑之間兩項(xiàng)濃度差較大，有利于類黃酮向溶劑中擴(kuò)散，所以溶劑量越大越有利于類黃酮的溶出，同時(shí)料液較少時(shí)，在微波處理的過(guò)程中，水分蒸發(fā)容易導(dǎo)致料液干涸，阻礙類黃酮的溶出；但是當(dāng)料液比大于1∶20（g∶mL）時(shí)，溶劑量過(guò)大，不利于已溶出的類黃酮對(duì)未浸出黃銅的協(xié)同浸提作用，從而在料液比大于1∶20（g∶mL）時(shí)，使類黃酮得率下降。所以最適宜的料液比為1∶20（g∶mL）。

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

為了確定提取長(zhǎng)白山野菊花中類黃酮的最佳提取工藝條件，及各因素對(duì)類黃酮提取的影響大小，在以上單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取微波處理強(qiáng)度、微波處理時(shí)間、提取液濃度及料液比4個(gè)可能影響類黃酮提取效果的因素，進(jìn)行4因素3水平的正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果，如表1。

表1 正交設(shè)計(jì)表Table1 Design of orthogonal test

從表2分析，在正交實(shí)驗(yàn)中利用同一水平試驗(yàn)之和K求得各水平試驗(yàn)的平均值k。根據(jù)k計(jì)算因素列的極差R，R表示該因素在其取值范圍內(nèi)試驗(yàn)指標(biāo)的變化幅度。

表2 極差分析表Table 2 Result of orthogonal test

R=kimax-kimin

根據(jù)每個(gè)因素的極差R，說(shuō)明各因素對(duì)類黃酮的得率都有一定的影響。根據(jù)極差R的大小分析，各因素對(duì)長(zhǎng)白山野菊花中類黃酮得率影響相關(guān)性排列為：微波處理強(qiáng)度＞料液比＞微波處理時(shí)間＞提取液（乙醇）濃度，說(shuō)明在微波法提取長(zhǎng)白山野菊花的試驗(yàn)中微波處理強(qiáng)度對(duì)類黃酮的得率影響最大，料液比對(duì)類黃酮得率的影響其次，接下來(lái)影響長(zhǎng)白山野菊花中類黃酮提取得率的是微波處理時(shí)間，對(duì)類黃酮得率影響最小的就是乙醇的濃度。

根據(jù)各試點(diǎn)以外的試驗(yàn)組合的平均得率分析，各因素的優(yōu)先水平為：A1、B3、C2、D2，所以長(zhǎng)白山野菊花中類黃酮提取工藝條件最佳組合為A1B3C2D2，即微波處理時(shí)間為 3 min、料液比為 1∶25（g∶mL）、提取液（乙醇）濃度為70%、微波處理強(qiáng)度為600 W。

3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)前面的正交試驗(yàn)結(jié)果可知，各因素對(duì)長(zhǎng)白山野菊花中類黃酮得率影響相關(guān)性排列為：微波處理強(qiáng)度＞料液比＞微波處理時(shí)間＞提取液（乙醇）濃度。通過(guò)正交試驗(yàn)確定最佳提取工藝條件為：即微波處理時(shí)間為 3 min、料液比為 1∶2（g∶mL）5、提取液（乙醇）濃度為70%、微波處理強(qiáng)度為600 W；不在試驗(yàn)組內(nèi)，因此在此條件下進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，類黃酮得率分別為：60.31 mg/g、59.84 mg/g、60.19 mg/g，平均值為 60.11 mg/g，根據(jù)3次重復(fù)試驗(yàn)得到的類黃酮得率高于正交實(shí)驗(yàn)及單因素試驗(yàn)的每組結(jié)果。所以長(zhǎng)白山野菊花中類黃酮提取工藝條件最佳組合為A1B3C2D2，即微波處理時(shí)間為 3 min、料液比為 1∶25（g∶mL）、提取液（乙醇）濃度為70%、微波處理強(qiáng)度為600 W。

4 結(jié)論

微波提取工藝是一種新型提取工藝技術(shù)，可以有效的節(jié)省時(shí)間，降低成本；長(zhǎng)白山野菊花使藥用性很高且來(lái)源普遍的植物。本實(shí)驗(yàn)采用普通微波爐處理，以水為溶劑進(jìn)行野菊花中類黃酮的提取后又利用傳統(tǒng)索氏提取處理料液，大幅度的提高了野菊花中類黃酮的得率。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果表明，長(zhǎng)白山野菊花中類黃酮提取的最佳微波提取工藝條件為：微波處理時(shí)間為3 min、野菊花粉末與提取液比為 1 ∶25（g∶mL）、提取液乙醇的濃度為70%、微波處理強(qiáng)度為600 W。

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