沈洪昇，趙秀梅，張富庚，胡人杰，史鵬程，顧娜

（天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津 300020）

牛蒡（Arctium lappa L.）是菊科牛蒡?qū)僦参铩Ｔa(chǎn)于我國，以野生為主，分布從東北至西南[1]。公元940年前后牛蒡傳入日本，并被培養(yǎng)成優(yōu)良品種，現(xiàn)在日本人把牛蒡根奉為營養(yǎng)和保健價值極佳的高檔蔬菜。近年來的研究表明，牛蒡根具有抗菌、抗氧化和降血脂等方面的生物活性[2-3]。筆者在之前的實驗中曾采用溶劑法對牛蒡根進(jìn)行了初步的提取分離，得到的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇等4個不同極性提取物，在體外抗腫瘤活性篩選中，表現(xiàn)出明確的細(xì)胞毒作用，尤以石油醚和氯仿提取物活性最佳[4]。本研究采用硅膠柱層析法對石油醚和氯仿提取物進(jìn)一步提取分離，MTT法比色法對這些洗脫組分進(jìn)行體外抗腫瘤活性的測定，從而確定了牛蒡根中抗腫瘤有效成分的所在部位，為牛蒡根的綜合利用提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

昆明種小鼠，體重18 g～22 g，雄性，SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.1.2 瘤株

人的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、小鼠肝癌Hep A腹水型和肉瘤S180腹水型，由天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所瘤源室提供。

1.2 藥品與試劑

牛蒡根，市售，購自津工超市。切片曬干經(jīng)粉碎機粉碎為干粉。

RPMI1640培養(yǎng)液：GIBCO公司，小牛血清：杭州四季青工程材料有限公司，MTT：北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司。無水乙醇、正丁醇、石油醚（30－60℃）、氯仿、乙酸乙酯均為分析純。

1.3 儀器

CO2孵育箱：TyTe公司；酶標(biāo)儀：Labsystems Dragon公司。

1.4 方法

1.4.1 樣品制備

1.4.1.1 牛蒡根石油醚、氯仿提取物的制備

牛蒡根干粉95%乙醇回流提取后，減壓回收溶劑，浸膏加適量水使混懸，依次以石油醚、氯仿萃取。將各萃取液分別濃縮，得石油醚、氯仿提取物。

1.4.1.2 石油醚提取物硅膠柱層析分離組分的制備

100目～200目硅膠玻璃管柱濕法裝柱，上樣3 g；分別用氯仿；氯仿：甲醇 9 ∶1；氯仿：甲醇 8 ∶2；氯仿：甲醇7∶3過柱洗脫，最后甲醇沖柱。試驗過程中用10 mL試管接取洗脫樣品，每份5 mL。經(jīng)TLC檢測，選取斑點集中的合并，減壓回收溶劑，將濃縮物再低溫真空干燥后，稱重并計算收率。

1.4.1.3 氯仿提取物硅膠柱層析分離組分的制備

100目～200目硅膠玻璃管柱濕法裝柱，上樣2 g；分別用氯仿 ∶甲醇8∶2、氯仿 ∶甲醇7∶3、氯仿 ∶甲醇2∶8洗脫，最后甲醇沖柱。試驗過程中用10 mL試管接取洗脫樣品，每份5 mL。經(jīng)TLC檢測，選取斑點集中的合并，減壓回收溶劑。將濃縮物再低溫真空干燥后，稱重并計算收率。

1.4.2 樣品對體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞生長的影響

1.4.2.1 待測樣品的配制

稱取牛蒡根層析物10 mg，加入含10%小牛血清RPMI 1640溶液2 mL，于超聲波儀中超聲5 min，使浸膏充分溶解或混懸，配制成5 mg/mL的儲備液。

精密吸取上述溶液適量，用含10%小牛血清的RPMI1640液配制成不同濃度的溶液。

1.4.2.2 細(xì)胞實驗過程[5]

取對數(shù)生長期MCF－7細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰酶消化后，吹打成單細(xì)胞懸液，用含10%小牛血清的RPMI 1640液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL，以每孔100 μL分別接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁。另外再抽取荷瘤HepA及S180小鼠腹水，PBS洗滌2次，用含10%小牛血清的RPMI 1640液稀釋成1×106/mL單細(xì)胞懸液，分別接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL。

于上述96孔板中加入不同濃度的待測樣品液100 μL，每個濃度平行4孔，樣品設(shè)5個～8個濃度梯度組，對照組加入等體積含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，使反應(yīng)體積為 200 μL。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h后，每孔加入5mg/mLMTT液10μL，37℃溫育4 h，1 000 r/min離心10 min，小心吸去上清液，每孔加人180 μL DMSO，震蕩，于酶標(biāo)儀570 nm處測吸光度（OD）值。按公式計算細(xì)胞生長抑制率。細(xì)胞存活率對劑量對數(shù)線性回歸計算IC50值。

抑制率（%）=（1－實驗組OD值/細(xì)胞對照OD值）×100%

2 結(jié)果

2.1 牛蒡根硅膠柱層析分離的實驗結(jié)果

牛蒡根石油醚提取物經(jīng)柱層析后，得到3個種組分 S－1（黃色澄清油狀物，677.4 mg）、S－2（褐色粘稠物，908.9 mg）和 S－3（深棕色粘稠的，766.4 mg）。牛蒡根氯仿提取物經(jīng)柱層析后，得到4個種組分L－1（淺棕色粘稠狀物質(zhì)，138 mg）、L－2（淺棕色粉末，160 mg）、L－3（淺棕色粉末狀提取物，660 mg）和L－4（淺棕色粉末，309 mg）。不同層析物得率結(jié)果，具體見表1。

表1 牛蒡根石油醚和氯仿提取物硅膠柱層析洗脫成分的得率結(jié)果Table 1 The yield of elution components from petroleum ether and chloroform extract of Burdock root

2.2 牛蒡根柱層析物對體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞生長的影響

由表2、表4中結(jié)果可以看出，牛蒡根各層析物S－1、S－2、S－3 和 L－1、L－2、L－3、L－4 在各濃度范圍內(nèi)對MCF－7、Hep A和S180細(xì)胞的生長均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用。對MCF－7細(xì)胞的IC50分別為832.3、76.24、＞500 μg/mL 和 131.31、147.01、315.95、＞500 μg/mL；對Hep A 細(xì)胞的 IC50分別為 398.42、97.97、253.04 μg/mL和 8.56、17.42、55.94、151.48 μg/mL；對 S180細(xì)胞的 IC50分 別 為 24.77、77.93、318.76 μg/mL 和 9.33、23.55、47.87、80.26μg/mL。相比較牛蒡根石油醚和氯仿提取物對三種細(xì)胞株的 IC50（222.59、59.07、52.86 μg/mL 和 265.93、76.80、73.62μg/mL）[4]，L－1 和 L－2 的細(xì)胞毒活性顯著增強，樣品的IC50至少降低了1.8倍以上。

表2 牛蒡根柱層析物對MCF-7細(xì)胞毒作用的結(jié)果Table 2 Cytotoxic effect of elution components from Burdock root on MCF-7 cell

表3 牛蒡根柱層析物對Hep A細(xì)胞毒作用的結(jié)果Table 3 Cytotoxic effect of elution components from Burdock root on Hep A cell

表4 牛蒡根柱層析物對S180細(xì)胞毒作用的結(jié)果Table 4 Cytotoxic effect of elution components from Burdock root on S180cell

3 討論

牛蒡在我國具有豐富的植物資源，除其果實牛蒡子作為我國的法定藥物外，其根、莖、葉均可作為草藥使用[6]。人們對牛蒡的研究已有數(shù)十年的歷史，研究目標(biāo)主要集中于牛蒡子，其抗腫瘤成分及活性方面的研究已經(jīng)比較深入 ，但對于牛蒡根的研究尚處于起步階段，認(rèn)識有限。目前牛蒡根作為一種潛在的具有預(yù)防癌癥的保健蔬菜在日本受到歡迎，而且對植物藥開發(fā)愈來愈加重視的歐美國家則已經(jīng)將牛蒡根作為主要的藥用部位來進(jìn)行研究[9]。故進(jìn)一步研究和評價牛蒡根的抗腫瘤作用，應(yīng)該是非常有意義的一項工作。

本項研究中，筆者對有明確抗腫瘤活性的牛蒡根石油醚、氯仿提取物做進(jìn)一步的柱層析分離后，得到的7個樣品。選用MCF－7和小鼠腫瘤S180、Hep A肝癌細(xì)胞，觀察各層析物對三種細(xì)胞的細(xì)胞毒活性的變化。結(jié)果，僅 S－1 對于 S180細(xì)胞、S－2對于 MCF－7 細(xì)胞較之粗提物，表現(xiàn)出較好的細(xì)胞毒活性。而其他的石油醚層析物其活性均有不同程度的下降。當(dāng)氯仿提取物柱層析后，除L－4外，其他部位對三個細(xì)胞株的細(xì)胞毒活性都明顯增加，尤以L－1、L－2活性增加最為明顯。這就表明牛蒡根抗腫瘤活性部位應(yīng)為氯仿層中分離的L－1、L－2?，F(xiàn)代研究資料表明，牛蒡根中含有聚炔類化合物，此類化合物主要特點是除具有不飽和三鍵結(jié)構(gòu)外，往往還含有烯的結(jié)構(gòu)，因而具有抗癌、抗炎、抗氧化等生物活性[10]。那么本實驗中所見牛蒡根的抗腫瘤生物活性，是否與其所含的“炔類化合物”相關(guān)，有待進(jìn)一步考察。筆者將在今后的試驗中，通過植化的方法（生物活性跟蹤法）對L－1和L－2這兩部分做進(jìn)一步的分離、純化，以期找到牛蒡根中明確的抗腫瘤活性成分。

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