王凌，孫利芹，周妍

（煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺(tái) 264005）

小球藻（Chlorellasp.）是一類普生性單細(xì)胞綠藻，含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、脂質(zhì)、葉綠素、維生素、微量元素和一些生物活性代謝產(chǎn)物，有“藥物藻類”之美譽(yù)[1]。有研究表明，小球藻干粉或其提取物能使免疫低下小鼠的細(xì)胞免疫功能有所恢復(fù)[2-4]。Tanaka等報(bào)道[3]小球藻提取物在小鼠抗腫瘤MethA的作用中，需要抑制性T淋巴細(xì)胞的參與，即通過淋巴器官中T細(xì)胞的活化，并增強(qiáng)腫瘤部位T細(xì)胞的補(bǔ)充來抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。Hasegawa等[5]研究給予白血病小鼠小球藻后，可恢復(fù)其對(duì)單核增生李斯特氏菌的清除力，感染部位的T細(xì)胞數(shù)目增加。

多糖是小球藻提取液中主要的活性成分之一，在抗腫瘤、抗病源菌、抗病毒方面具有顯著效果[6]。施瑛、盛建春等[7-8]針對(duì)蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）多糖進(jìn)行了體外抗腫瘤和免疫功能的研究，而關(guān)于普生小球藻多糖對(duì)正常小鼠細(xì)胞免疫系統(tǒng)影響的報(bào)道較少。以普生小球藻為研究對(duì)象，以其多糖對(duì)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖，腹腔巨噬細(xì)胞增殖、吞噬中性紅及釋放NO能力的影響為指標(biāo)，詳細(xì)考察了小球藻多糖對(duì)健康小鼠細(xì)胞免疫系統(tǒng)的影響，以期為小球藻及其多糖作為功能食品基料的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品

小球藻多糖由小球藻藻泥經(jīng)細(xì)胞破碎，熱水提取，Sevag法去蛋白，乙醇沉淀，透析，冷凍干燥得到多糖干粉。精密稱取多糖干粉4 mg，溶于20 mL的RPMI1640培養(yǎng)基中，得濃度為200 μg/mL的多糖溶液，用直徑為0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌備用。使用時(shí)依次倍比稀釋可得濃度為 100，50，25，12.5 μg/mL的溶液。

1.2 試劑及儀器

刀豆蛋白 A（ConA）、脂多糖（LPS）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、四甲基偶氮唑鹽（MTT）、十二烷基磺酸鈉（SDS） 均為 Sigma公司；RPMI－1640 培養(yǎng)基：Gibco公司；新生小牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司；Synergy HT型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀：美國Bio－TEK公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞株

清潔級(jí)昆明種小鼠，雌雄不限，體重18 g～22 g，山東綠葉制藥有限公司（許可證號(hào)：SYXK（魯）20030020）。小鼠巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞株RAW264.7（ATCC TIB－71），上海細(xì)胞研究所提供。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 小鼠單核腹腔巨噬細(xì)胞Raw264.7吞噬中性紅實(shí)驗(yàn)

取處于對(duì)數(shù)生長期的小鼠單核－巨噬細(xì)胞RAW264.7，胰酶消化收集細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，加入96 孔板，100 μL/孔，置 37 ℃、5%CO2培養(yǎng) 2 h，棄上清，磷酸鹽緩沖液洗3次，洗去未貼壁的細(xì)胞，補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)液，加入用培養(yǎng)液稀釋的不同濃度的小球藻多糖 100 μL/孔，并以 100 μL LPS（2 μg/mL）、培養(yǎng)液作陽性和陰性對(duì)照；培養(yǎng)24 h后棄上清，每孔加入0.08%中性紅溶液100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)20 min后，傾上清，PBS洗3遍，每孔加入細(xì)胞溶解液0.2 mL，室溫下靜置過夜，待細(xì)胞溶解后，即在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)540 nm處的吸光度。

1.4.2 小鼠單核腹腔巨噬細(xì)胞Raw264.7釋放NO能力的檢測(cè)

參照1.4.1制備巨噬細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×105/mL，于 96 孔板接種 100 μL/孔，置 37 ℃，5%CO2培養(yǎng)24 h。加藥同上。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，從每個(gè)孔取50 μL培養(yǎng)上清液到一個(gè)新的96孔板中，加入等量的Griess試劑，室溫反應(yīng)10 min，30 min之內(nèi)在520 nm～550 nm之間（540 nm）測(cè)定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算NO的含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.3 小鼠單核腹腔巨噬細(xì)胞Raw264.7增殖能力的測(cè)定

參照1.4.1，加藥培養(yǎng)24 h后，SRB法檢測(cè)[8]。

1.4.4 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

無菌取脾，制備小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為 8×106個(gè)/mL～10×106個(gè)/mL。按照 1.4.1 加藥，陽性對(duì)照為ConA 100 μL/孔（10μg/mL），置 5%CO2，37 ℃培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，MTT法檢測(cè)[9]。

1.4.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。t檢驗(yàn)采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件包完成，以P＜0.05表示差異顯著；P＜0.01表示差異極其顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 小球藻多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力的影響

巨噬細(xì)胞作為機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成成分，在體液免疫和細(xì)胞免疫中發(fā)揮中心作用。它可以直接吞噬外來異物及衰老的自身細(xì)胞，還可分泌白介素等細(xì)胞因子，進(jìn)而發(fā)揮抗病毒、抗腫瘤作用[10]。表1數(shù)據(jù)顯示，小球藻多糖在12.5μg/mL～200μg/mL

表1 小球藻多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬中性紅活性的影響（±s，n=9）Table 1 Effect of Chlorella polysaccharides on neutral red uptake of mouse macrophage（±s，n=9）

表1 小球藻多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬中性紅活性的影響（±s，n=9）Table 1 Effect of Chlorella polysaccharides on neutral red uptake of mouse macrophage（±s，n=9）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05；**P＜0.01。

實(shí)驗(yàn)組給藥劑量/（μg/mL）吸光度OD540空白對(duì)照組 － 0.756±0.007脂多糖（LPS） 2 1.168±0.013**200 1.155±0.021**100 1.178±0.009**50 1.406±0.074**25 1.032±0.039*12.5 1.095±0.009**小球藻多糖

濃度范圍內(nèi)，均可顯著或極顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的作用（P＜0.05或 P＜0.01），濃度為 50 μg/mL 時(shí)，對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的增強(qiáng)作用最強(qiáng)，比空白對(duì)照組高出1.86倍，是陽性對(duì)照組（LPS）的1.2倍，隨后促進(jìn)作用有所下降。一般認(rèn)為，巨噬細(xì)胞的代謝狀況和其吞噬能力直接相關(guān)，代謝旺盛，則說明巨噬細(xì)胞的吞噬能力增強(qiáng)；代謝減弱，則吞噬功能下降。因此本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明小球藻多糖能夠促進(jìn)機(jī)體巨噬細(xì)胞的代謝能力。

2.2 小球藻多糖對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響

在免疫細(xì)胞中NO是由誘導(dǎo)型NO合酶催化生成的，正常情況下，哺乳動(dòng)物體內(nèi)可連續(xù)產(chǎn)生少量NO，細(xì)胞因子刺激免疫細(xì)胞可產(chǎn)生大量NO。NO在免疫系統(tǒng)中作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的一種重要介質(zhì)而起作用[10]。不同濃度小球藻多糖對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響如表2 所示?？梢钥闯?，在 12.5 μg/mL～200 μg/mL 的濃度范圍內(nèi)，小球藻多糖可明顯地促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO，并呈一定的劑量的依賴性，隨著濃度的升高，誘生NO的能力增強(qiáng)，在濃度為100 μg/mL時(shí)，其NO濃度是空白對(duì)照組的1.96倍。但是與陽性對(duì)照組脂多糖相比，促進(jìn)作用稍弱。表明小球藻多糖可通過誘導(dǎo)和激活腹腔巨噬細(xì)胞來產(chǎn)生NO，從而達(dá)到增強(qiáng)細(xì)胞免疫能力的目的。

表2 小球藻多糖對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響（±s，n=9）Table 2 Effect of Chlorella polysaccharides on NO production（±s，n=9）

表2 小球藻多糖對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響（±s，n=9）Table 2 Effect of Chlorella polysaccharides on NO production（±s，n=9）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05；**P＜0.01。

實(shí)驗(yàn)組給藥劑量/（μg/mL）NO濃度/（μmol/mL）空白對(duì)照組 － 3.598±0.509脂多糖（LPS） 2 8.905±0.385**200 7.408±0.763**100 7.068±1.503**50 6.728±0.385**25 6.116±0.976**12.5 4.823±0.787*小球藻多糖

2.3 小球藻多糖對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞增殖的影響

小球藻多糖對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞增殖的影響見圖1。

圖1 小球藻多糖對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of Chlorella polysaccharides on the proliferation of mouse peritoneal macrophage（±s，n=9）

在 12.5 μg/mL～100 μg/mL 的濃度范圍內(nèi)，小球藻多糖可顯著地促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞增殖，與對(duì)照組相比有極顯著差異（P＜0.01）。在 50 μg/mL 時(shí)，促進(jìn)作用最強(qiáng)。隨后隨濃度繼續(xù)增加，促進(jìn)作用減弱，至200 μg/mL時(shí)，與空白對(duì)照組相比，無顯著性差異（P＞0.05）LPS在2 μg/mL濃度下可極顯著促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的增殖（P＜0.01）。這一結(jié)果與2.1中小球藻多糖對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力影響結(jié)果一致，進(jìn)一步證明了巨噬細(xì)胞代謝功能與吞噬能力這一關(guān)系。

2.4 小球藻多糖對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

脾臟是機(jī)體內(nèi)重要的免疫器官，富含T、B淋巴細(xì)胞，加之其易于分離，是體外試驗(yàn)中淋巴細(xì)胞的重要來源。測(cè)定淋巴細(xì)胞體外增殖反應(yīng)是檢測(cè)淋巴細(xì)胞功能的常用方法[10－11]。本研究中圖2數(shù)據(jù)顯示，低濃度（12.5 μg/mL）的小球藻多糖與空白對(duì)照組相比，無顯著性差異（P＞0.05），在 25 μg/mL～200 μg/mL 的濃度范圍內(nèi)，小球藻多糖可極顯著地刺激并促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的增殖（P＜0.01），且隨多糖濃度提高，刺激作用不斷增強(qiáng)，表明小球藻多糖對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖活性呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。

圖2 小球藻多糖對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of Chlorella polysaccharides on the spleen lymphopoiesis of mouse（±s，n=9）

3 結(jié)論

小球藻多糖在 12.5 μg/mL～200 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬中性紅有明顯的促進(jìn)作用，并可顯著地促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞增殖，二者都在50μg/mL時(shí)促進(jìn)作用達(dá)最大值；實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，小球藻多糖可明顯地促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO，并呈一定的劑量的依賴性，在濃度為100 μg/mL時(shí)，其NO濃度是空白對(duì)照組的1.96倍，但是與陽性對(duì)照組脂多糖相比，促進(jìn)作用稍弱；在 25 μg/mL～200 μg/mL 的濃度范圍內(nèi)，小球藻多糖可極顯著地刺激并促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的增殖（P＜0.01），且隨多糖濃度提高，作用增強(qiáng)，表明小球藻多糖對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖活性呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。本次研究結(jié)果顯示小球藻多糖在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)等方面可能有重要作用和良好的應(yīng)用前景。

：

[1]曹吉祥,李德尚,王金秋.10種淡水常見浮游藻類營養(yǎng)組成的研究[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,1997,36(2):22－27

[2]Miyazawa Y,Murayama T,Ooya N,et al.Immunomodulation by a unicellular green algae (Chlorella pyrenoidosa)in tumor－bearing mice[J].J Ethnopharmacol,1988,24:135－146

[3]Tanaka K,Tomita Y,Tsuruta M,et al.Oral administration of Chlorella vulgaris augments concomitant antitumor immunity[J].Immunopharmacol immunotoxicol,1990,12:277－291

[4]Justo G Z,Silva M R,Queivoz M L,et al.Effects of the green algae Chlorella vulgaris on the response of the host hematopoietic system to intraperitoneal ehrlich ascites tumor transplantation in mice[J].Immunopharmacol immunotoxical,2001,23:119-132

[5]Hasegawa T,Okuda M,Makino M,et al.Hot water extracts of Chlorella vulgaris reduce opportunistic infection with Listeria monocytogenes in C57BL/6 mice infected with LP-BM5 murine leukemia viruses[J].Inter J Immunopharmacol,1995,17:505-512

[6]陳穎,李文彬,孫勇如.小球藻生物技術(shù)研究應(yīng)用現(xiàn)狀及展望[J].生物工程進(jìn)展,1998,18(6):12-16

[7]施瑛.蛋白核小球藻多糖制備及增強(qiáng)免疫功能的研究[D].江蘇：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文,2005:34-49

[8]盛建春.蛋白核小球藻多糖(Chlorella pyrenoidosa)的制備和In vitro抗腫瘤活性的研究[D].江蘇：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文,2007:12-45

[9]劉建文.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué):新技術(shù)與新方法[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2003:30-59

[10]陳炅然,胡庭俊,程富勝.蕨麻多糖對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖和一氧化氮分泌的影響[J].中國獸醫(yī)科技,2005,35(9):737

[11]郭志廷,伊鵬霏,王魯.經(jīng)分子修飾后的人參皂苷-Rh2對(duì)小鼠免疫功能的影響[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志,2007(1):16