任璐，張鋒華，苗君蒞，蔡濤，王輝，肖楊

（光明乳業(yè)股份有限公司乳品研究院乳業(yè)生物技術國家級重點實驗室，上海 200436）

隨著我國國民經濟的迅猛發(fā)展，人們的工作和生活方式更加快節(jié)奏、高效率。加之總需應對各種激烈的市場競爭，使越來越多的人們長期處于亞健康狀態(tài)，從而導致人體免疫力下降。與此同時，人民生活水平的提高及生活質量觀的日益興起，人們在對飲食多樣化、營養(yǎng)科學化方面提出了更高的要求，渴望通過調整飲食結構、補充營養(yǎng)物質來提高自身的健康水平和生命質量。綜觀這幾年的保健食品，增強免疫力的產品總是最多的，但以液態(tài)奶為主要原料的免疫牛奶產品較少。低聚果糖、菊粉、富硒酵母作為重要的功能性食品配料，關于其促進腸道益生菌增殖[1-3]和抗氧化[4]的功能性報道很多。以牛奶這個普通食品為載體，通過添加低聚果糖、菊粉、富硒酵母等原料，利用主要成分各自的功能特性和相互的協同作用設計開發(fā)了一款功能牛奶。本文通過小鼠實驗從細胞免疫、體液免疫、單核-巨噬細胞功能及NK細胞活性4個方面，進一步研究和全面評價自制研發(fā)的功能牛奶對其機體免疫調節(jié)的影響。

1 材料與方法

1.1 原料

牛奶：光明乳業(yè)牧場；低聚果糖：上海格信健康科技有限公司；菊粉：廣州市德比歐貿易有限公司；富硒酵母：安琪酵母股份有限公司。

1.2 儀器及試劑

BIO-RAD 680型酶標儀：美國Bio-Rad公司；HERAcell 240型CO2培養(yǎng)箱：德國Heraeus公司；TW 20恒溫水浴鍋：德國Julabo公司；BX61顯微鏡：日本Olympus公司；DMI 3000-3N/PH倒置顯微鏡：德國Leica公司。高速乳化機-ULTRA-TURRAX IKA T18：IKA，德國；數顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司。

綿羊紅細胞（SRBC）、YAC-1細胞、雞紅細胞：北京聯合大學應用文理學院保健食品功能檢測中心；RPMI 1640培養(yǎng)液：美國CellGro公司；都氏試劑（NaHCO31.0 g/L，K3[Fe（CN）6]0.2 g/L，KCN 0.05 g/L）；SA緩沖液（10 mmol/L醋酸鈉，pH5.0）；ConA、吩嗪二甲酯硫酸鹽、氧化型輔酶I：美國Sigma公司；小牛血清：長春西諾生物科技有限公司；MTT：美國Promega公司；NP40：上海研卉生物科技有限公司；豚鼠血清、墨汁：上海麥莎生物科技有限公司；Giemsa染液：德國AppliChem公司；其他為常規(guī)試劑。

1.3 劑量設計

根據普通成人每日飲用500 mL（按60 kg體重計）牛奶計算，由于樣品量超出動物最大承受量，需要將樣品濃縮。故將功能牛奶配方設計為：稱取低聚果糖120 g、菊粉50 g和富硒酵母1.5 mg加入100 mL牛奶中（水浴鍋中預熱到80℃），經過高速剪切混勻、均制、殺菌后作為功能牛奶供試液，即將功效成分增加100倍，相當于人體推薦量每日5 mL/60 kg。

1.4 受試樣品

根據本試驗劑量設計要求及功能牛奶供試液的推薦劑量，設定低、中、高3個劑量組為每日0.4 mL/kg·bw、0.8 mL/kg·bw 和 2.5 mL/kg·bw，相當于人體推薦量的5倍、10倍、30 倍。即取供試液 0.4 mL、0.8 mL、2.5 mL，加蒸餾水至20 mL，按照灌胃量0.4 mL/20 g·bw對小鼠灌胃。空白對照組和牛奶對照組分別給予蒸餾水和樣品牛奶。

1.5 動物分組及喂養(yǎng)

將250只體重為（20±3）g的清潔級ICR小鼠[由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，許可證號：SCXK-（京）2007-0005]，按體重隨機分入5個試驗大組，每組50只（分別進行NK細胞和淋轉實驗，DTH、脾指數和胸腺指數實驗，溶血空斑和溶血素實驗，碳廓清實驗和吞噬實驗）。每個試驗大組中均設有空白對照組、牛奶對照組及低、中、高劑量組五小組，每小組10只。

1.6 試驗方法

《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》（2003版）規(guī)定[5]：在細胞免疫功能、體液免疫功能、單核——巨噬細胞功能、NK細胞活性4個方面任2個方面結果陽性，可判定該受試樣品具有增強免疫力功能作用。其中細胞免疫功能測定項目中的2個試驗結果均為陽性，或任1個試驗的2個劑量組結果陽性，可判定細胞免疫功能測定結果陽性。體液免疫功能測定項目中的2個試驗結果均為陽性，或任1個試驗的2個劑量組結果陽性，可判定體液免疫功能測定結果陽性。單核——巨噬細胞功能測定項目中的2個試驗結果均為陽性或任1個試驗的兩個劑量組結果陽性，可判定單核——巨噬細胞功能結果陽性。NK細胞活性測定試驗的1個以上劑量組結果陽性，可判定NK細胞活性結果陽性。因此，選取評價以上四方面來作為評判功能牛奶對小鼠免疫調節(jié)的作用。

1.6.1 喂養(yǎng)并稱重

按照劑量設計連續(xù)喂養(yǎng)小鼠30 d，每周稱重1次，計算試驗初、中期、末期體重。

1.6.2 臟器/體重比值的測定

動物連續(xù)給樣30 d后，頸椎脫臼處死，取脾臟和胸腺稱重，分別計算脾臟體重比值和胸腺體重比值。

1.6.3 細胞免疫功能測定

1.6.3.1 ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化試驗

動物連續(xù)給樣30 d后，頸椎脫臼處死，取脾臟制成脾細胞懸液，調整細胞濃度為2×106個/mL，將細胞懸浮液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL，一孔加50 μL ConA 液（相當于 5 μg/mL），另一孔作為對照，置5%CO2，37℃培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結束前4 h，每孔輕輕吸去上清液0.7 mL，加入0.7 mL不含小牛血清的PRMI1640 培養(yǎng)液，同時加入 MTT（5 mg/mL）50 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，培養(yǎng)結束后，每孔加入1 mL酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結晶完全溶解后，以570 nm波長進行比色，記錄試驗結果。

1.6.3.2 DHT測試

致敏：動物連續(xù)給樣30 d后，每鼠腹部去毛，范圍約3 cm×3 cm，將1%的DNFB溶液50 μL均勻涂抹致敏。DHT的產生與測定：5 d后，用1%DNFB溶液10 μL均勻涂抹于小鼠右耳（兩面）進行攻擊。24 h后，頸椎脫臼處死小鼠，用打孔器取下直徑8 mm的左右耳片，稱重并計算腫脹度。

1.6.4 體液免疫功能測定

1.6.4.1 抗體生成檢測試驗

動物連續(xù)給樣30 d后，將脫纖維綿羊紅細胞免疫5 d后，動物頸椎脫臼處死，取脾臟，制成脾細胞懸液，調整細胞濃度為5×106個/mL。將表皮層培養(yǎng)基（1 g瓊脂糖加雙蒸水至100 mL）加熱溶解后，放入45℃水浴保溫，與等量pH7.2～7.4且2倍濃度的Hanks液混合，分裝在小試管，每管0.5 mL，再向管內加入50 μL 10%SRBC，20 μL脾細胞懸液，迅速混勻，傾倒于已刷瓊脂薄層的6 cm平皿上，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中溫浴1.5 h，然后用SA緩沖液稀釋的補體（1∶10）加入到平皿中，繼續(xù)溫浴1.5 h后，計算溶血空斑數。

1.6.4.2 血清溶血素試驗

動物連續(xù)給樣30 d后，用2%（體積比）SRBC免疫動物5 d后，眼眶采血，頸椎脫臼處死，分離血清。在96孔微量血凝板上加25 μL生理鹽水，分別在第一排加25 μL血清，以后各排座作對倍稀釋，每孔加1%SRBC100 μL，振蕩后 37℃放置 3 h，當血球對照出現沉落后觀察結果。

1.6.5 單核－巨噬細胞功能測定

1.6.5.1 小鼠碳廓清試驗

動物連續(xù)給樣30 d后，尾靜脈注射1∶3稀釋的印度墨汁，待墨汁注入，立即計時。注入墨汁后2 min和10 min，分別從眼靜脈叢取血20 μL，并將其加到2 mL 0.1%Na2CO3溶液中，用分光光度計在600 nm波長處測OD值，以Na2CO3溶液作空白對照。根據動物體重、肝重和脾重計算吞噬指數。

1.6.5.2 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗

動物連續(xù)給樣30 d后，每鼠腹腔注射20%雞紅細胞懸液1 mL，間隔30 min，頸椎脫臼處死，固定于鼠板上，剪開腹壁皮膚，注射生理鹽水2 mL，轉動鼠板1 min，吸出腹腔洗液1 mL，分滴于2片玻片上，37℃孵箱濕孵30 min，用生理鹽水漂洗，晾干，以1∶1丙酮甲醇溶液固定，4%Giemsa－磷酸緩沖液染色3 min，再用蒸餾水漂洗晾干，用油鏡鏡檢，計算吞噬百分數和吞噬指數。

1.6.6 NK細胞活性測定

動物連續(xù)給樣30 d后，頸椎脫臼處死，取脾臟，制成脾細胞懸液（效應細胞），取傳代后24 h YAC－1細胞加1640完全培養(yǎng)液，調整細胞濃度為1×105個/mL（靶細胞），取靶細胞和效應細胞各100 μL效靶比（50∶1），加入U型96孔培養(yǎng)板，靶細胞自然釋放孔加靶細胞和培養(yǎng)液各100 μL，最大釋放孔加靶細胞和1%NP40各100 μL，上述各項均設3個復孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，每孔吸取上清液100 μL置平底96孔培養(yǎng)板中，同時加入LDH基質液100 μL，反應 3 min，每孔加入1 mol/L的HCl30 μL終止，用酶標儀在490 mm處測定光密度值（OD）。

1.7 數據統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 細胞免疫功能測定

2.1.1 ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化實驗

淋巴細胞在免疫調控中起重要作用，其增殖反應是反映淋巴細胞活化和功能的重要指標。功能牛奶在不同劑量條件下對小鼠脾淋巴細胞增殖的刺激作用，結果見表1。

表1結果表明，經口給予小鼠不同劑量的功能牛奶30 d后，與空白對照組和牛奶對照組比較，每周各組的小鼠體重均無顯著差異，2.5 mL/kg·bw劑量組的OD值顯著高于空白對照組（p＜0.01），亦顯著高于牛奶對照組（p＜0.05），而0.4 mL/kg·bw劑量組和0.8 mL/kg·bw劑量組的OD值與對照組均沒有發(fā)生顯著變化（p＞0.05），淋巴細胞在免疫調控中起重要作用，特異性免疫是由淋巴細胞識別外源性抗原開始，通過增殖和分化成效應細胞行使清除抗原的功能。因此，淋巴細胞的增殖反應是反映淋巴細胞活化和功能的重要指標[6]。說明功能牛奶在2.5 mL/kg·bw劑量時能夠刺激淋巴細胞增殖的有絲分裂源活性，顯著增強其細胞免疫功能。

表1 功能牛奶對小鼠脾淋巴細胞轉化的影響（n=10）Table 1 Effect of functional milk on activity of lymphocyte transformation of mice

2.1.2 對小鼠遲發(fā)性變態(tài)反應（DHT）的測試

遲發(fā)型變態(tài)反應是由T細胞介導的細胞免疫應答的一種類型，也是常見的一種免疫反應，外周血液中T細胞亞群的數目和比值測定是估計體內免疫調節(jié)平衡狀態(tài)的最有意義的參數，也是疾病嚴重程度和預后的重要標志之一[7]。功能牛奶對小鼠遲發(fā)性變態(tài)反應（DHT）的影響見表2。

表2結果表明，經口給予小鼠不同劑量的功能牛奶30 d后，與空白對照組和牛奶對照組比較，每周各組的小鼠體重均無顯著差異；各組小鼠的胸腺指數和脾指數均無顯著差異；在DTH試驗中，2.5 mL/kg·bw劑量組的左右耳重量差值（腫脹度）顯著高于空白對照組（p＜0.01），亦顯著高于牛奶對照組（p＜0.05）；而牛奶對照組、0.4 mL/kg·bw劑量組和0.8 mL/kg·bw劑量組略高于空白對照組，但無統(tǒng)計學差異。以上結果說明2.5 mL/kg·bw劑量組對小鼠遲發(fā)性變態(tài)反應（DHT）有顯著影響，顯著增強其細胞免疫功能。

表2 功能牛奶對小鼠遲發(fā)性變態(tài)反應（DHT）的影響（n=10）Table 2 Effect of functional milk on DTH of mice

2.2 體液免疫功能測試

體液免疫功能在免疫調控中起重要作用。功能牛奶在不同劑量條件下對小鼠體液免疫（溶血空斑數和抗體積數）的影響，結果見表3。

表3結果表明，經口給予小鼠不同劑量的功能牛奶30 d后，與空白對照組和牛奶對照組比較，每周各組的小鼠體重均無顯著差異；在抗體生成細胞檢測試驗中，2.5 mL/kg·bw劑量組的空斑數顯著高于空白對照組（p＜0.01），亦高于牛奶對照組（p＜0.05）；而牛奶對照組、0.4 mL/kg·bw劑量組和0.8 mL/kg·bw劑量組與空白對照組間無統(tǒng)計學差異。在血清溶血素試驗中，2.5 mL/kg·bw劑量組的抗體積數顯著高于空白對照組（p＜0.01），亦高于牛奶對照組（p＜0.05）；而牛奶對照組、0.4 mL/kg·bw劑量組和0.8 mL/kg·bw劑量組與空白對照組間無統(tǒng)計學差異。以上結果說明2.5 mL/kg·bw劑量組有助于提高小數體液抗體水平。

2.3 單核－巨噬細胞功能測試

巨噬細胞是機體免疫系統(tǒng)的一種重要免疫細胞，不僅具有很強的吞噬功能，而且是主要的抗原提呈細胞，在非特異性和特異性免疫應答中均起關鍵作用 。巨噬細胞在抗腫瘤免疫、抗感染免疫及免疫調節(jié)中均起重要作用，其吞噬功能的強弱可以直接反映細胞免疫功能的強弱[9]。

表3 功能牛奶對小鼠體液免疫（溶血空斑數和抗體積數）的影響（n=10）Table 3 Effect of functional milk on humoral immunity of mice

2.3.1 小鼠碳廓清試驗

碳廓清法可以表觀小鼠網狀內皮系統(tǒng)的吞噬功能，通過測定其吞噬指數的變化來研究不同劑量組對小鼠網狀內皮系統(tǒng)的吞噬功能的影響，結果見表4。

表4 功能牛奶對小鼠碳廓清試驗的影響（n=10）Table 4 Effect of functional milk on clearance capacity of carbon of mice

表4結果表明，經口給予小鼠不同劑量的功能牛奶30 d后，與空白對照組和牛奶對照組比較，每周各組的小鼠體重均無顯著差異；在碳廓清試驗中，2.5 mL/kg·bw劑量組的吞噬指數顯著高于空白對照組（p＜0.01），亦高于牛奶對照組（p＜0.05）；而牛奶對照組、0.4 mL/kg·bw劑量組和0.8 mL/kg·bw劑量組與空白對照組間無統(tǒng)計學差異。以上結果說明2.5mL/kg·bw劑量組對小鼠有提高小鼠吞噬指數的作用，對小鼠的非特異免疫功能有顯著促進作用。

2.3.2 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗

巨噬細胞的吞噬功能在免疫反應中起著至關重要的作用。功能牛奶在不同劑量條件下對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力的影響，結果見表5。

由表5結果可知，經口給予小鼠不同劑量的功能牛奶30 d后，與空白對照組和牛奶對照組比較，每周各組的小鼠體重均無顯著差異；在小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗中，0.8 mL/kg·bw劑量組的吞噬率和吞噬指數顯著高于空白對照組（均p＜0.05）；2.5 mL/kg·bw劑量組的吞噬百分率和吞噬指數均顯著高于空白對照組（均p＜0.01），亦均顯著高于牛奶對照組（均p＜0.01），牛奶對照組與空白對照組間無統(tǒng)計學差異。以上結果說明，0.8 mL/kg·bw劑量組和2.5 mL/kg·bw劑量組對小鼠的非特異免疫功能有顯著促進作用。

表5 功能牛奶對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力的影響（n=10）Table 5 Effect of functional milk on phagocytic capacity of macrophages of mice

2.4 NK細胞活性測試

NK細胞（natural killer cell，自然殺傷細胞）是與T、B細胞并列的第三類群淋巴細胞，可非特異直接殺傷靶細胞，這種天然殺傷活性既不需要預先由抗原致敏，也不需要抗體參與，且不受主要組織相容性復合體（MHC）的約束，因此，把NK細胞活性作為非特異性免疫的重要指標[10]。功能牛奶對小鼠NK細胞活性的影響見表6。結果可知，經口給予小鼠不同劑量的功能牛奶30 d后，與空白對照組和牛奶對照組比較，每周各組的小鼠體重均無顯著差異；在小鼠NK細胞活性測試試驗中，2.5 mL/kg·bw劑量組的NK細胞活性顯著高于空白對照組（p＜0.05），且顯著高于牛奶對照組（p＜0.05）。以上結果說明2.5 mL/kg·bw劑量組對于增強NK細胞活性有顯著促進作用。

表6 功能牛奶對小鼠NK細胞活性的影響（n=10）Table 6 Effect of functional milk on activity of NK cells of mice

3 結論

本次試驗從細胞免疫、體液免疫、單核-巨噬細胞功能及NK細胞活性4個方面，對功能牛奶的免疫功能的調節(jié)作用進行了研究。結果表明，不同劑量的功能牛奶對小鼠的體重差異無顯著影響；0.8 mL/kg·bw劑量組對于提高巨噬細胞吞噬能力有顯著作用；2.5 mL/kg·bw劑量組對提高小鼠脾淋巴細胞轉化、增強小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應、增加溶血空斑數和抗體體積、以及提高小鼠碳廓清能力和巨噬細胞吞噬能力，提高NK細胞活性均有顯著作用。該研究證明功能牛奶能全面提高機體免疫能力，且具有食用安全性。

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