顧華杰，孫 燕，李良智，王桃云，胡翠英，袁紅霞

(蘇州科技學(xué)院化學(xué)生物與材料工程學(xué)院，江蘇蘇州215009)

灰樹花(Grifola frondosa)是一種重要的食藥用真菌，其子實(shí)體富含氨基酸、多糖、微量元素等多種營(yíng)養(yǎng)成分。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，多糖是其中最主要的一類生物活性成分［1］?；覙浠ǘ嗵?Griflola frondosas polysaccharides，GFP)是一類生物大分子，富含 β－1，6－及 β－1，3－糖苷鍵［2］，具有顯著的免疫調(diào)節(jié)［3－4］、抗腫瘤［5－6］、抗病毒［7－8］及抗糖尿?。?－10］等效果，對(duì)防治高血壓、高血脂、肥胖癥、肝臟疾病也有一定的療效［4］，且無(wú)毒副作用［11］。多糖提取的方法很多，如熱水浸提法、酸提法、堿提法、酶解法、超聲波輔助法、微波法、超臨界流體萃取法等［12］。酶、超聲波、微波、超臨界流體萃取等新技術(shù)的運(yùn)用雖然可以提高多糖的得率，但是成本較高，同時(shí)也缺乏大型的可用于工廠化生產(chǎn)的超聲或微波設(shè)備，因此，這些新技術(shù)大都仍處于實(shí)驗(yàn)室研究改進(jìn)階段，實(shí)際應(yīng)用中仍以水提法、酸提法、堿提法等傳統(tǒng)工藝為主。稀酸和稀堿可促進(jìn)細(xì)胞破碎，釋放多糖，但也易使多糖的糖苷鍵斷裂，形成較多的單糖而使多糖的提取率降低，并對(duì)設(shè)備造成腐蝕。熱水浸提法不需要特殊的設(shè)備，應(yīng)用最多，但耗時(shí)較長(zhǎng)，提取率不高［13－14］。因此，在開發(fā)新技術(shù)將其應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)的同時(shí)，改進(jìn)傳統(tǒng)工藝、提高產(chǎn)率也是一個(gè)重要的方面。相對(duì)于正交實(shí)驗(yàn)法從固定的幾組實(shí)驗(yàn)條件中選擇出最佳工藝［15］，響應(yīng)面法(Response Surface Methodology，RSM)能建立二次多項(xiàng)式模型擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，研究各因素之間的相互作用，及各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，在整個(gè)區(qū)域內(nèi)找到各因素的最佳組合及最優(yōu)的響應(yīng)值，可大大降低生產(chǎn)實(shí)踐過(guò)程中的原料和能源浪費(fèi)［16－17］。RSM 一 般包括三個(gè)步驟:首先利用Plackett－Burman設(shè)計(jì)以較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)從眾多因素中快速地篩選出對(duì)響應(yīng)值影響顯著的因素［18］，然后采用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)使各因素快速有效地逼近最佳響應(yīng)區(qū)域［18］，最后通過(guò) Box－Behnken設(shè)計(jì)擬合出因素和響應(yīng)值的多元二次方程，通過(guò)對(duì)回歸方程分析尋求最優(yōu)工藝［19］。目前，RSM在食品、醫(yī)藥、生物等領(lǐng)域已有廣泛應(yīng)用，在生物過(guò)程優(yōu)化中主要用于培養(yǎng)條件和提取工藝的優(yōu)化［20］?？轮镜壤庙憫?yīng)面法優(yōu)化了嗜熱厭氧代謝工程菌發(fā)酵產(chǎn)乙醇的培養(yǎng)基［21］。張花利等利用響應(yīng)面法優(yōu)化了乙醇提取黑豆皮中黃銅的工藝［22］。鑒于此，本研究運(yùn)用RSM對(duì)熱水浸提灰樹花多糖的工藝進(jìn)行優(yōu)化，為更好地開發(fā)利用灰樹花多糖提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

灰樹花子實(shí)體干品 福建省古田縣江艷霞食用菌經(jīng)營(yíng)部，高速萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎后，過(guò)300μm篩，得子實(shí)體干粉，用索氏抽提法脫脂肪［23］。

FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司;FA2004型電子分析天平 上海恒平科學(xué)儀器有限公司;HH－S21－8－S水浴鍋、DFZ－6050型真空干燥箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;DL－5－B離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;TU－1901雙光束紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器責(zé)任有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多糖提取

1.2.1.1 提取過(guò)程 參考文獻(xiàn)［14］。取脫脂肪的子實(shí)體干粉→加入蒸餾水→熱水浴浸提→離心(5000r/min，10min)取上清液→測(cè)定多糖含量，計(jì)算多糖得率。

1.2.1.2 提取次數(shù)的單因素實(shí)驗(yàn) 取子實(shí)體干粉，在料液比1∶20、pH6.0、浸提溫度50℃、浸提時(shí)間 2h的條件下，進(jìn)行熱水浸提，離心得上清液，測(cè)定多糖含量，計(jì)算多糖得率。然后將離心后的沉淀物在相同條件下再浸提3次，分別測(cè)定各次浸提液的多糖含量。

1.2.1.3 Plackett－Burnman設(shè)計(jì)［18］選擇最佳的提取次數(shù)，利用Design－Expert 7.0.0軟件進(jìn)行Plackett－Burnman設(shè)計(jì)，考察浸提溫度、浸提時(shí)間、料液比、pH對(duì)粗多糖得率的影響，通過(guò)軟件分析找出具有顯著影響的主要因素。

1.2.1.4 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)［18］根據(jù) Plackett－Burnman實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)主要因素最陡爬坡實(shí)驗(yàn)的變化方向和步長(zhǎng)。其中，有顯著正效應(yīng)的因素，數(shù)值應(yīng)增大;有顯著負(fù)效應(yīng)的因素，數(shù)值應(yīng)減小。影響較大的因素，數(shù)值變化的步長(zhǎng)應(yīng)較小;影響較小的因素，步長(zhǎng)應(yīng)適當(dāng)增大。

1.2.1.5 Box－Behnken設(shè)計(jì)［19］根據(jù)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定主要因素的水平，利用Design－Expert 7.0.0軟件進(jìn)行Box－Behnken設(shè)計(jì)，通過(guò)建立二次多項(xiàng)式模型確定最佳條件和最優(yōu)得率，并進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 多糖純化［14］合并粗多糖提取液→離心(5000r/min，10min)取上清液→真空干燥儀濃縮至原體積的1/5→加入1/2體積 Sevage試劑(V氯仿∶V正丁醇=4∶1)去蛋白3次→50℃水浴脫色4h，其中一半用過(guò)氧化氫氧化法脫色，另一半用活性炭吸附法脫色［24］→加入4倍體積的無(wú)水乙醇沉淀多糖(4℃靜置12h)→離心(5000r/min，10min)取沉淀→無(wú)水乙醇洗滌沉淀3次→干燥→得水溶性粗多糖。

分別測(cè)定粗多糖提取液、濃縮后、脫蛋白后、脫色后和醇沉后的多糖含量，根據(jù)溶液體積換算為多糖質(zhì)量，計(jì)算回收率。其中，由于脫色時(shí)分為兩份，分別用兩種方法進(jìn)行，所以每種方法得到的多糖質(zhì)量都乘以2后再計(jì)算回收率。

1.2.3 多糖測(cè)定 分別用苯酚－硫酸法和3，5－二硝基水楊酸(DNS法)測(cè)定多糖溶液中的總糖含量和還原糖含量［25］，按以下公式計(jì)算多糖得率。

多糖得率(%)=(總糖含量－還原糖含量)×多糖溶液體積/子實(shí)體干重×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)都進(jìn)行三次重復(fù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Design－Expert 7.0.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、統(tǒng)計(jì)及作圖［26］。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取次數(shù)的單因素實(shí)驗(yàn)

將提取次數(shù)單獨(dú)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)的原因是:第一、由預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，提取次數(shù)對(duì)多糖得率的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他因素，但這實(shí)際是由測(cè)定誤差造成的。隨著提取次數(shù)的增加，浸提液體積成倍增加，特別是對(duì)于浸提次數(shù)多、料液比大的實(shí)驗(yàn)組，其浸提液體積遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于浸提次數(shù)少、料液比小的實(shí)驗(yàn)組。這樣一方面由于體積增大，使多糖被稀釋，造成多糖含量測(cè)定的誤差，另一方面大體積往往是小體積的幾倍甚至十幾倍，而其測(cè)得的多糖濃度并未成比例減少，因此體積越大計(jì)算得到的得率越高，掩蓋了其他因素的效應(yīng)。第二、提取次數(shù)是整數(shù)，而響應(yīng)面法得到的結(jié)果一般都是非整數(shù)，因此用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的提取次數(shù)并無(wú)實(shí)際操作意義。

圖1中，根據(jù)前兩次多糖得率之和與四次多糖得率總和之比可以看出前兩次提取得到的多糖占四次提取多糖總量的90%以上，第3和第4次提取的多糖得率明顯降低。雖然隨著提取次數(shù)的增加，總的多糖得率會(huì)相應(yīng)增大，但是較多的提取次數(shù)對(duì)于實(shí)際生產(chǎn)來(lái)說(shuō)并不經(jīng)濟(jì)。因此，隨后的實(shí)驗(yàn)都選擇浸提次數(shù)為兩次。

圖1 提取次數(shù)對(duì)多糖得率的影響Fig.1 Effect of different times of extraction on the yield of GFP

2.2 Plackett－Burnman 設(shè)計(jì)

Plackett－Burnman實(shí)驗(yàn)的結(jié)果和分析見表1～表3。從表2的方差分析中可以看出實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷膒值=0.0206＜0.05，表明該模型具有顯著性，擬合很好。浸提溫度、浸提時(shí)間、料液比的p值都小于0.05，都顯著影響多糖得率，而pH的p值大于0.05，對(duì)多糖得率無(wú)顯著影響。從表3的顯著性分析中也可以看出浸提溫度、浸提時(shí)間、料液比的貢獻(xiàn)率均超過(guò)20%，三個(gè)因素的累積貢獻(xiàn)率將近75%，為主要影響因素。這與其他研究從單因素實(shí)驗(yàn)中選擇出的進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)或響應(yīng)面分析的因素是一致的［27－28］。其中浸提溫度的效應(yīng)值為6.17，表明其為正效應(yīng)因素，浸提時(shí)間和料液比的效應(yīng)值分別為－5.47和－5.49，都是負(fù)效應(yīng)因素。從p值、貢獻(xiàn)率和效應(yīng)值的大小都可以看出，這三個(gè)因素對(duì)多糖得率的影響大小為浸提溫度＞料液比＞浸提時(shí)間。

表1 Plackett－Burnman設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Design and results of the Plackett－Burnman experiment

表2 Plackett－Burnman實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头讲罘治鯰able 2 ANOVA for Plackett－Burnman experiment model

表3 影響因素的顯著性分析Table 3 The significance analysis of impact factor

2.3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Plackett－Burnman實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇浸提溫度、浸提時(shí)間、料液比這三個(gè)主要影響因素進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)，pH對(duì)結(jié)果無(wú)顯著影響，選用中間值pH6。通過(guò)分析預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，調(diào)整實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，最終方案為:浸提溫度逐步升高，步長(zhǎng)為5℃，而浸提時(shí)間逐步縮短，步長(zhǎng)為0.5h，料液比也逐漸降低，步長(zhǎng)為5mL。結(jié)果如表4所示，發(fā)現(xiàn)第4組實(shí)驗(yàn)條件下多糖得率最高，說(shuō)明其比較接近最大響應(yīng)值區(qū)域，因此選擇這組條件(85℃，2.5h，1∶25)作為隨后的 Box－Behnken 設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)，進(jìn)一步優(yōu)化。

表4 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Design and results of the steepest ascent experiment

2.4 Box－Behnken設(shè)計(jì)

Box－Behnken實(shí)驗(yàn)的結(jié)果和分析見表5～表7?？梢钥闯?，模型的p值＜0.0001，極顯著，而失擬項(xiàng)的p值=0.5856＞0.1，不顯著，模型的 R2=0.9991，且R2校正值與R2預(yù)測(cè)值非常接近，說(shuō)明模型擬合程度高，相關(guān)性很好，可用于灰樹花菌絲體多糖熱水浸提法的預(yù)測(cè)。通常情況下變異系數(shù)(C.V.)越低，實(shí)驗(yàn)的可信度和精確度越高，本模型的C.V.值為0.36%，表示其可信度和精確度很好。Adeq Precision用于衡量信噪比，該值大于4視為合理，本實(shí)驗(yàn)達(dá)到62.658，表明模型具有足夠的信號(hào)來(lái)響應(yīng)該設(shè)計(jì)。從表6各因素的p值可以看出，二次項(xiàng)(A2，B2，C2)都極顯著，但一次項(xiàng)(A，B，C)和交互項(xiàng)(AB，AC，BC)均不顯著。圖2為軟件分析得到的響應(yīng)面的三維曲面圖。

表5 Box－Behnken設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Design and results of the Box－Behnken experiment

表6 Box－Behnken實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头讲罘治鯰able 6 ANOVA for Box－Behnken experiment model

表7 Box－Behnken實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕y(tǒng)計(jì)學(xué)分析Table 7 Statistical analysis of Box－Behnken experiment model

表8 灰樹花多糖純化的回收率Table 8 Recovery rate of GFP purification

使用Design－Expert 7.0.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式擬合，得到回歸方程:多糖得率=－517.592+10.537A+44.695B+3.038C+6.000 ×10－4AB+4.500×10－4AC+0.024BC－0.062A2－9.048B2－0.063C2，其中A、B、C分別代表浸提溫度、浸提時(shí)間、料液比的數(shù)值。由軟件求得最優(yōu)條件為:浸提溫度85.05℃、浸提時(shí)間2.51h、料液比1∶25.02，此時(shí)的多糖得率最高，為24.472%。在浸提溫度85℃、浸提時(shí)間2.51h、料液比1∶25的條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到多糖得率為24.423% ±0.335%，與預(yù)測(cè)值僅相差0.05%。從最優(yōu)條件可以看出，浸提溫度、時(shí)間和料液比都不是越大越好，這與其他很多研究的結(jié)果是一致的［27－31］。一方面，浸提溫度過(guò)高、時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能引起多糖分解，而料液比過(guò)大可能引起后續(xù)濃縮過(guò)程中多糖損失增大;另一方面，即使這些因素的增大可能使多糖得率略有增加，但同時(shí)也增大了提取液、能源和時(shí)間的消耗，增加了后續(xù)濃縮等工藝的成本，并不經(jīng)濟(jì)。

圖2 浸提溫度、浸提時(shí)間和料液比對(duì)灰樹花多糖得率交互影響的三維曲線圖Fig.2 3D surface graphs of mutual－influence for extraction temperature，time and ratio of material to liquid on the yield of GFP

2.5 多糖純化

由表8可看出，脫蛋白和脫色步驟的多糖損失較多，導(dǎo)致總回收率較低。特別是活性炭吸附脫色后的回收率不到50%，這是由于活性炭對(duì)多糖也存在吸附作用［32］。過(guò)氧化氫氧化脫色過(guò)程中，其強(qiáng)氧化性會(huì)使多糖的羥基等活潑基團(tuán)氧化，使多糖降解，從而降低多糖的回收率［32］?；覙浠ㄖ械亩嗵嵌嘁缘鞍拙厶堑男问酱嬖冢?］，因此脫蛋白的過(guò)程也會(huì)造成多糖的損失。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)綜合運(yùn)用單因素實(shí)驗(yàn)、Plackett－Burnman設(shè)計(jì)、最陡爬坡實(shí)驗(yàn)和Box－Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化了熱水浸提法提取灰樹花多糖的工藝。單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示浸提2次效果最好;Plackett－Burnman實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，影響多糖得率的主要因素依次是:浸提溫度、料液比、浸提時(shí)間;最陡爬坡實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步接近了最佳響應(yīng)區(qū)域;通過(guò)Box－Behnken設(shè)計(jì)結(jié)果的分析得出最佳提取條件是:浸提溫度85℃、浸提時(shí)間2.51h、料液比1∶25，經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到多糖得率為24.423%。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，單因素實(shí)驗(yàn)、Plackett－Burnman設(shè)計(jì)、最陡爬坡實(shí)驗(yàn)和Box－Behnken設(shè)計(jì)相結(jié)合，能在較短時(shí)間內(nèi)根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析快速找到多糖提取的關(guān)鍵參數(shù)，并對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，所得工藝條件比正交實(shí)驗(yàn)更精確。

在多糖純化過(guò)程中，總回收率較低，主要是脫蛋白和脫色過(guò)程中多糖損失較多。因此，需從純化效果和多糖回收率等方面對(duì)多糖純化過(guò)程作進(jìn)一步研究。

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