蔣錫龍，魏彥鋒，孫玉霞，史紅梅，董興全，李彥奎

(山東省釀酒葡萄科學研究所，山東濟南250100)

桃原產于我國西部和中亞一帶，是我國栽培的主要水果之一。桃子果實味道鮮美，營養(yǎng)豐富，富含果糖、葡萄糖、有機酸、維生素C、鈣、鐵等營養(yǎng)成分。桃屬呼吸躍變型果實，多數品種采收正值高溫季節(jié)，采后很容易軟化腐爛［1］。桃子果實含有豐富的風味物質［2］，是釀酒的良好原材料。將桃深加工成桃酒，不僅可以解決桃子儲藏、運輸難的問題，還可增加產品的附加值。酵母在果酒的釀造中起著至關重要的作用，選擇合適的酵母是果酒釀造成敗的關鍵因素之一。但是，現在果酒生產中所采用的酵母大多數為葡萄酒酵母［3］，尚無用于桃酒釀造的專用酵母。在桃的栽培環(huán)境中，經過長期的自然選擇，野生酵母菌群已經適應了桃的品質和特征。本實驗從濟南郊區(qū)多年的桃栽培園區(qū)中選育出優(yōu)良釀酒酵母，經過馴化后，作為桃酒釀造的出發(fā)菌株，對桃酒釀造工藝進行了優(yōu)化，獲得了適合桃酒釀造的專用菌株和發(fā)酵工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種來源 濟南本地桃園種植成熟桃子、土壤，采樣時間2009年桃成熟季;成熟桃 采摘于濟南近郊桃園;白砂糖 市售;酵母提取物 OXOID;蛋白胨 北京奧博星;葡萄糖 國藥集團;無水乙醇 天津廣大;氯化鉀 國藥集團;氫氧化鉀 國藥集團;硫酸銅 國藥集團;亞硫酸 天津科密歐;氯化鎂 上海三浦化工;膠回收試劑盒 、DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、dNTPs、克隆載體等 TaKaRa生物工程(大連)有限公司;增殖培養(yǎng)基:成熟桃去皮榨汁，90℃水浴20min;分離培養(yǎng)基:麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基，WL培養(yǎng)基;放大發(fā)酵培養(yǎng)基:桃汁加糖至 16°Bx，121℃滅菌15min，用時添加 SO2濃度為 80mg·L－1;YEPD 培養(yǎng)基:酵母提取物10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加 dd H2O至1000mL，固體加入瓊脂15g;酵母氮源基礎培養(yǎng)基(YNB)和酵母碳源基礎培養(yǎng)基(YCB)美國BD公司，0.2μm抽濾后備用。

YXQG02手提式電熱壓力蒸汽消毒器 山東新華安得;SW－CJ－ZD超凈工作臺 蘇州凈化;JYZB530水果榨汁機 九陽股份有限公司;WYT－32型手持糖量計 泉州光學儀器廠;GSP－9160MBE型隔水式恒溫靜置培養(yǎng)箱 上海博迅;HZQ－Q全溫振蕩器 哈爾濱東聯;Eppendorf mastercycler gradient PCR儀 德國;DYY－12型電泳儀 北京六一儀器廠;AlphaImager EP通用型凝膠成像系統(tǒng) 美國;Sigma3－30K實驗室高速冷凍離心機 德國。

表1 感官評價標準Table 1 Standard of sensory evaluation

1.2 實驗方法

1.2.1 野生酵母的分離 1g試樣加入100mL無菌生理鹽水(NaCl，0.9%)中，震蕩30min，取1mL加入增殖培養(yǎng)基，28℃靜置培養(yǎng)12h，梯度稀釋，涂布于麥芽汁瓊脂平板，28℃靜置培養(yǎng)3d。隨機挑取單菌落在WL平板上劃線，28℃靜置培養(yǎng)5d，根據單菌落特征分類，選取單克隆，并進行形態(tài)與生殖方式觀察。

1.2.2 篩選酵母的初級篩選和放大發(fā)酵篩選 初級篩選:杜氏管發(fā)酵法［4］，每株酵母重復3次，篩選產氣能力強且香氣較好的菌株。

放大發(fā)酵實驗:采用桃汁發(fā)酵法，供試菌株接入放大發(fā)酵培養(yǎng)基，22℃靜置，發(fā)酵完畢測定酒精度、感官品評風味，品評標準見表1，每株酵母重復3次。篩選產酒能力強、產香好的酵母菌株。

1.2.3 篩選酵母的馴化選育 制備乙醇含量分別為8%、10%、12%、14%、16%、18%的6級 YEPD培養(yǎng)基平板，將篩選出的野生酵母自乙醇含量8%平板開始接種，培養(yǎng)后挑取優(yōu)勢單克隆接種到下一級培養(yǎng)基上，依次接種，直到酵母不再生長。

1.2.4 選育酵母菌株的鑒定 生理生化鑒定［5］。

分子生物學鑒定:堿裂解法［6］提取酵母基因組DNA，酵母26S rDNA D1/D2區(qū)PCR擴增引物:NL1:5'－GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG－3'和 NL4:5'－GGTCCGTGTTTCAAGACGG－3'［7－8］。

反應體系:Taq DNA Polymerse Buffer(1×)，MgCl22.0mmol/L，dNTPs 40μmol/L，Taq 酶 1U，模板DNA 60ng，引 物 各 0.6μmol/L，加 無 菌 超 純 水至50μL。

反應程序:95℃ 5min;94℃ 45s，54℃ 30s，72℃45s，循環(huán)30次;72℃延伸10min。

擴增產物電泳后回收，接入克隆載體，由山東省農業(yè)科學院測序中心完成測序。測序結果在GenBank數據庫中進行BLAST分析。

1.2.5 選育酵母耐受性實驗 將選育酵母等量接種于不同 pH(1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5)、不同 SO2濃度(60、100、150、200、300、400mg·L－1)、不同 KCl濃度(0.7、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2mol·L－1)的帶有杜氏管的YEPD液體培養(yǎng)基中，28℃靜置培養(yǎng)，每1h觀察一次產氣情況;接種選育酵母到有杜氏管的YEPD液體中，不同溫度(37、45℃)培養(yǎng)，觀察產氣情況。

1.2.6 選育酵母最適接種量的測定［9］酵母菌YEPD中培養(yǎng)16h，取1mL稀釋，顯微鏡鏡檢計數，計算其酵母含量。新鮮桃汁糖度調至23°Bx，添加SO2濃度為80mg·L－1，等量分成六份。每份加入酵母菌為:0.5、1、2、3、4、4.5(×107cfu·mL－1)，22℃發(fā)酵 9d。酒精蒸餾后用酒精計測定，殘還原糖用斐林法測定［11］，揮發(fā)酸、總酸以指示劑法滴定。

1.2.7 選育酵母發(fā)酵性能測定 CO2失重實驗［10］:新鮮桃汁加白砂糖到糖度 23°Bx，SO2濃度為 80mg·L－1，選育菌株最適接種量接種，以活性干酵母D21為對照，22℃靜置，每24h稱量重量變化。

發(fā)酵過程中糖度、酒精度變化實驗:新鮮桃汁加糖至糖度為 23°Bx，SO2濃度為 80mg·L－1，選育菌株最適接種量接種，D21為對照，22℃發(fā)酵9d，每24h取樣測定酒精度、糖度。發(fā)酵完成后測定揮發(fā)酸、總酸。

1.2.8 桃果酒釀制的工藝流程 桃子清洗→去皮、去核→榨汁→80mg·L－1SO2護色→果膠酶低溫處理→清汁→調整糖度→接種→發(fā)酵→過濾去渣→后發(fā)酵→陳釀→下膠處理→滅菌→灌裝→成品。

1.2.9 產品質量指標 感官評定指標和理化測定:感官品評標準見表1。酒精蒸餾后用酒精計測定;總酸、揮發(fā)酸用指示劑滴定法;殘?zhí)怯渺沉址y定;可溶性物質用密度瓶法測定［11］。微生物檢測［12－13］:測定菌落總數 (cfu·mL－1)、大腸桿菌數 (MPN·100mL－1)和致病菌。

表2 初選酵母形態(tài)特征鑒定結果Table 2 Morphologic of wild yeast

2 結果與討論

2.1 野生酵母分離

不同酵母在WL培養(yǎng)基上的菌落顏色及形態(tài)不同［14］，依據野生酵母的菌落顏色及形態(tài)，選取10株具有釀酒酵母特征和2株非釀酒酵母特征的菌株，在顯微鏡下進行其菌體形態(tài)和無性繁殖方式鑒定。12株菌的菌落、菌體形態(tài)特征及無性繁殖方式的結果見表2。

2.2 初級篩選及放大發(fā)酵實驗結果

經杜氏管法發(fā)酵，J05和J09產氣少且很快停止，J06和J07起酵在48h以后，其他8株均在12h內產氣，量大且持續(xù)時間長。8株菌株進行了放大發(fā)酵實驗，發(fā)酵完畢后其酒精度和香氣特征見表3。J03和J11酒香氣濃郁，酒精度也高，但達不到果酒釀造生產的需要，需要進一步培養(yǎng)馴化。

表3 放大發(fā)酵實驗結果Table 3 Amplification test of 8 strains of yeast

2.3 馴化選育結果

馴化選育結果見表4。J03在乙醇含量為12%及以上的培養(yǎng)基上都不能生長，而J11可以耐受16%的乙醇，但不能耐受18%的乙醇。挑取J11在16%乙醇培養(yǎng)基上長勢最優(yōu)的單菌落保種，用于后續(xù)實驗。

2.4 選育酵母J11的鑒定

2.4.1 生理生化鑒定結果 J11在電子顯微鏡下菌體形態(tài)見圖1，生理生化鑒定結果見表5。J11可以同化葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖及棉籽糖，銨鹽只能同化硫酸銨，在含糖不高于50%的培養(yǎng)基上能夠生長，含糖為60%時則不能生長，在放線菌酮兩個梯度平板上都不生長，這與釀酒酵母的特征相符。

表4 菌株馴化選育結果Table 4 Taming and breeding of J03 and J11

圖1 J11在電子顯微鏡下菌體形態(tài)Fig.1 Mycelium morphology of strain J11 under an electron microscope

表5 J11生理生化鑒定結果Table 5 Carbon and nitrogen assimilation of strain J11

2.4.2 分子生物學鑒定 PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，產物條帶大小為600bp左右(圖2)。測序長度為614bp，序列在 GenBank核酸數據庫中進行BLAST在線分析，與數據庫中模式菌株S.cescerevisiae(U44806)同源片段相似性為100%。經過生理生化鑒定和分子鑒定，確定 J11為釀酒酵母(S.cescerevisiae)。

圖2 J11 26S rDNA D1/D2區(qū)PCR擴增電泳圖譜Fig.2 PCR amplification electrophoresis patterns of 26S rDNA D1/D2 domain from J11

2.5 選育酵母J11耐受性實驗

耐受性實驗結果見表6。耐酸實驗中J11在pH4.5時起酵最快，pH越低起酵越慢;SO2濃度對J11影響很小，只有在400mg·L－1時起酵稍晚;在滲透壓實驗中，隨著KCl濃度的提高，J11起酵時間越長，當 KCl濃度達到 1.8mol·L－1時，J11 不產氣。在 37℃和42℃兩個溫度，J11都生長，表明其能耐受37℃和42℃兩個溫度。

表6 J11耐受性實驗結果Table 6 The stress resistance of low pH、SO2concentration and high osmotic

2.6 J11最適接種量實驗

最適接種量實驗結果如表7，5種發(fā)酵酒的揮發(fā)酸、總酸含量差距不大，殘還原糖也都符合釀造干酒的要求。酒精度的差距比較明顯，在接種量為3.0×107cfu·mL－1時，酒精度最高，對糖的利用率也最高，確定其為酵母菌株J11的發(fā)酵接種量。

2.7 發(fā)酵性能實驗結果

2.7.1 CO2失重實驗結果 CO2釋放總量和變化曲線和CO2日生成量變化曲線見圖3、圖4。發(fā)酵結束時，J11 總失重 10.637g·100mL－1，對照 D21 總失重10.509g·100mL－1。由圖 3、圖 4，在發(fā)酵前 5d D21 的CO2釋放量大于J11，但CO2釋放總量J11大于D21，說明J11發(fā)酵較D21平緩，但總發(fā)酵能力較D21強。

表7 J11最適接種量實驗結果Table 7 Optimal inoculation quantity test of J11

圖3 CO2釋放總量變化曲線Fig.3 Total weight lose of fermentation test

圖4 CO2日生成量變化曲線Fig.4 Weight lose of fermentation test each day

2.7.2 發(fā)酵過程中糖度、酒精度變化 圖5為發(fā)酵過程中糖度、酒精度變化曲線，發(fā)酵結束后，J11和D21所產酒精度分別為12.8°和12.6°，殘還原糖分別為2.8、3.1g·L－1，由此可知 J11 產酒精能力強于 D21，且殘還原糖量也比D21少。但發(fā)酵的整個過程中，前5天，D21產酒精量要比J11高，剩余的糖比J11少。所以，J11對糖的利用率和酒精轉化率都高于D21，J11的發(fā)酵比D21平緩，這與CO2失重實驗結果相一致。

2.8 產品質量評定

感官評定指標及結果見表8，桃果酒為淺黃色透明液體，均一穩(wěn)定，具有明顯桃果實香氣和風味，只是因為原料的成熟度不夠，酸度稍高。

桃果酒的理化指標和衛(wèi)生指標(見表9)均符合或高于國家果酒標準，因而其釀造工藝流程合理。

3 結論

本實驗選育出的酵母J11經鑒定為釀酒酵母(S.cescerevisiae)，各項性能優(yōu)越。J11酵母釀造桃果酒，發(fā)酵平緩，產酒能力強，所產果酒香氣濃郁，風味物質種類、含量都較商品酵母D21要多或高，是一株很好的桃果酒釀造酵母，具有很好的產業(yè)應用價值。桃果酒釀造工藝優(yōu)化后獲得的桃酒各項指標都優(yōu)于或達到國家果酒標準，證明其工藝流程合理。實驗證明桃果實，營養(yǎng)豐富，含有豐富的風味物質，適合釀酒。但桃果實的果膠含量比較高，且桃汁在空氣中容易氧化變色，所以在桃榨汁后需馬上添加一定量的 SO2或者維生素 C，并加入果膠酶在低溫(0～4℃)下處理，最后棄去沉淀，獲得高質量、高產率的桃汁。另外桃果實的成熟度對桃酒的產品質量影響較大，桃成熟度不夠時，生產的桃果酒酸度較高，風味、口感較差，需進行蘋果酸－乳酸發(fā)酵調整，且調整工藝較為復雜，所以須選擇成熟度好的桃進行桃果酒釀造。

表8 感官評定結果Table 8 The organoleptic evaluation of peach fruit wine

表9 桃果酒的理化、衛(wèi)生指標Table 9 The physicochemical and hygienic standards of peach fruit wine

圖5 發(fā)酵過程中糖度、酒精度變化曲線Fig.5 The transformations of alcohol and remaining sugar concentration

［1］魏好程.桃果實采后貯藏保鮮及其品質控制的研究［D］.儋州:華南熱帶農業(yè)大學，2005.

［2］胡玲，李麗萍，王友升.桃李果實風味物質的研究進展［J］.安徽農業(yè)科學，2010，38(7):3707－3709，3711.

［3］王燕，金利.峨眉山野生獼猴桃釀酒酵母篩選研究［J］.食品工業(yè)科技，2012，33(3):178－179，248.

［4］權英，張偉，李長文，等.釀造紅棗果酒的酵母菌選種研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2004，30(11):39－41.

［5］巴尼特JA.酵母菌的特征與鑒定手冊［M］.青島:青島海洋大學出版社，1991:140－174.

［6］Lorenz T C，Anand V C，Payne G S.High－throughput protein extraction and immunoblotting analysis in Saccharomyces cerevisiae［J］.Methods Mol Biol，2008，457:13－27.

［7］Kurtzman CP，Robnett CJ.Identification and phylogeny of ascomycetous yeasts from analysis of nuclear large subunit(26S)ribosomal DNA partial sequences［J］.Antonie Leeuwenhoek，1998，73(4):331－371.

［8］Nicola F，Mario C，Raffaele R，et al.Indigenous yeast communities in the environment of“Rovello bianco”grape variety and their use in commercial white wine fermentation［J］.World J Microbiol Biotechnol，2010，26(2):337－351.

［9］余曉紅，汪志君，方維明.麥汁中啤酒酵母的最適接種量研究［J］.釀酒科技，2003，118(4):73－74.

［10］李箏，韓北忠，陳晶瑜，等.優(yōu)良釀酒酵母菌的發(fā)酵性能研究［J］.中國釀造，2008，196(19):10－12.

［11］NY/T 1508－2007.綠色食品果酒［S］.北京:中華人民共和國農業(yè)部，2007.

［12］GB/T4789.2—2003.食品衛(wèi)生微生物學檢驗菌落總數測定［S］.北京:中華人民共和國衛(wèi)生部，中國國家標準化管理委員會，2003.

［13］GB/T4789.32—2002.食品衛(wèi)生微生物學檢驗大腸菌群的快速檢測［S］.北京:中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局，2002.

［14］Cavazza A，Grando M S，Zini C.Rilevazione della flora microbicadi most ievini［J］.Vignevini，1992，9:17－20.