王金鵬，李奕璇，任琴琴，金征宇

(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122)

大豆脂肪氧合酶能夠催化多不飽和脂肪酸解產(chǎn)生醛、酮等氧化產(chǎn)物，給食品的風(fēng)味、口感等帶來不良的影響。目前最常用的去除大豆脂肪氧合酶活性的方法就是加熱鈍酶法［1］，但這將導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶出率偏低、蛋白功能特性降低、產(chǎn)生不良風(fēng)味、大豆蛋白溶解度下降，降低食品營養(yǎng)價值等問題［2］。另有相關(guān)報(bào)道采用環(huán)糊精抑制脂肪氧合酶催化過程，如Estrella等［3］研究了環(huán)糊精能包埋外源底物從而使其的氧化反應(yīng)受到抑制;Roque Bru［4］研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)糊精的加入使酶催化反應(yīng)的速率降低。但是這些報(bào)道普遍認(rèn)為環(huán)糊精空腔包埋了底物亞油酸分子，從而致使酶催化氧化受抑制，但從環(huán)糊精－酶超分子體系來看，環(huán)糊精能直接與相關(guān)酶發(fā)生作用［5］。例如Punpeng等人［6］發(fā)現(xiàn)環(huán)糊精抑制α－淀粉酶分子對生淀粉的降解消化能力，于博等人發(fā)現(xiàn)β－環(huán)糊精能夠競爭性的抑制普魯蘭酶的催化活性［7］。因此本文提出假設(shè)——環(huán)糊精能夠直接抑制脂肪氧合酶的活性，在假設(shè)基礎(chǔ)上研究影響環(huán)糊精抑制LOX酶活的因素，這對于揭開環(huán)糊精抑制脂肪氧合酶催化的影響機(jī)制、明確環(huán)糊精在脂肪氧合酶催化氧化反應(yīng)中的作用提供了重要的依據(jù)，為環(huán)糊精與某些催化酶類相互作用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

β－ CD、H3BO3、Na2B4O7·10H2O、吐溫 －20、NaOH、HCL、無水乙醇 均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;脂肪氧合酶(LOX－1，EC，Type I－S，46000U/mg)、亞油酸(LA，純度≥98%)均購于Sigma－Aldrich(上海)貿(mào)易有限公司。

電子天平 梅特勒－托利多儀器有限公司;Delta320pH計(jì) 梅特勒－托利多儀器有限公司;移液槍 BeyonLab Scientific Instrument(上海);TU－1900雙光束紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 脂肪氧合酶活性的測定 采用分光光度法對脂肪氧合酶的活性進(jìn)行測定，具體步驟如下:在25℃，pH為9.0條件下，以亞油酸為底物的3mL反應(yīng)體系在234nm處每分鐘增加0.001吸光度值定義為一個酶活單位。取500μL酶液移入2.5mL的底物溶液中，混勻后于25℃水浴中恒溫4min，用5mL無水乙醇終止反應(yīng)，混勻后測定反應(yīng)液在234nm處的吸光度?？瞻讟訛?.5mL酶液中加入5mL無水乙醇，再加入2.5mL底物溶液，于25℃水浴恒溫4min。

1.2.2 環(huán)糊精抑制脂肪氧合酶活性的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 酶反應(yīng)在25℃，通過改變環(huán)糊精、酶液和亞油酸三者的添加順序來進(jìn)行驗(yàn)證:

a.取500μL酶液于試管中，加入1.44mL緩沖液，然后加入1mL環(huán)糊精溶液，充分混勻，反應(yīng)4min后，再加入60μL亞油酸，混勻，反應(yīng)4min后，加入5mL無水乙醇終止反應(yīng)。于234nm處1cm光程的石英比色皿中測吸光度。

b.取1mL環(huán)糊精于試管中，加入1.44mL緩沖液，再加入60μL亞油酸，充分混合，4min后加入500μL酶液，4min后加入5mL無水乙醇終止反應(yīng)。于234nm處測吸光度。

c.將1mL環(huán)糊精、1.44mL緩沖液、500μL酶液和60μL亞油酸同時加入試管，反應(yīng)8min后終止。于234nm處測吸光度。

d.不加環(huán)糊精，取500μL酶液，加入2.44mL緩沖溶液，混勻，加入60μL亞油酸，反應(yīng)8min后，加入5mL無水乙醇，終止反應(yīng)。于234nm處測吸光度。

1.2.3 環(huán)糊精抑制脂肪氧合酶活性的單因素實(shí)驗(yàn)

環(huán)糊精抑制脂肪氧合酶催化氧化活性的實(shí)驗(yàn)主要受溫度、pH、環(huán)糊精濃度以及Fe3+、Fe2+的濃度的影響，實(shí)驗(yàn)方法為:

取500μL酶液，加入1mL環(huán)糊精，1.44mL的緩沖溶液，在水浴中反應(yīng)30min后，加入60μL亞油酸，反應(yīng) 4min后，加入5mL無水乙醇終止反應(yīng)，于234nm處測吸光度。

1.2.3.1 溫度影響 pH9，環(huán)糊精濃度為10mmol/L時，不添加 Fe3+和 Fe2+，研究 5、10、15、20、25、30、35、40、45℃水浴下，環(huán)糊精對脂肪氧合酶的抑制效果的影響趨勢。

1.2.3.2 pH影響 在25℃，環(huán)糊精濃度為10mmol/L時，不添加 Fe3+和 Fe2+，研究 pH4、5、6、7、8、9、10、11、12時，環(huán)糊精對脂肪氧合酶的抑制效果的影響趨勢。

1.2.3.3 環(huán)糊精濃度影響 25℃下pH為9時，不添加 Fe3+和 Fe2+，研究環(huán)糊精濃度為 10、1、0.01、1 ×10－4、1 ×10－6、1 ×10－8、1 ×10－12mmol/L 時，環(huán)糊精對脂肪氧合酶的抑制效果的影響趨勢。

1.2.3.4 Fe3+濃度影響 25℃下pH9，環(huán)糊精濃度為10mmol/L 時，不添加 Fe2+，研究 Fe3+濃度為0.5、0.1、0.05、0.01、0.005μmol/L 時，環(huán)糊精對脂肪氧合酶的抑制效果的影響趨勢。

1.2.3.5 Fe2+濃度影響 25℃下，pH9，環(huán)糊精濃度為10mmol/L 時，不添加 Fe3+，研究 Fe2+濃度為0.5、0.1、0.05、0.01、0.005μmol/L 時，環(huán)糊精對脂肪氧合酶的抑制效果的影響趨勢。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，對溫度、pH、環(huán)糊精濃度、Fe3+濃度和Fe2+濃度這五個因素三個水平進(jìn)行L18(35)正交實(shí)驗(yàn)。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

利用SPSS軟件(19.0英文版)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析及方差分析，判斷顯著因素［8］。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析與處理 本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中紫外分析數(shù)據(jù)均為4次重復(fù)6次平行，熒光光譜和圓二色譜數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)3次平行，使用OriginPro 8.5進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖形繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 環(huán)糊精抑制脂肪氧合酶活性的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

從圖1中可以看出，與對照組相比，環(huán)糊精的添加能夠抑制脂肪氧合酶的活性，且添加次序造成對LOX的抑制程度也不同:先加環(huán)糊精和酶作用一段時間后再加底物的抑制率(a)最大，三者一起加入的抑制率次之(c)，而先讓環(huán)糊精與底物充分作用最后加入酶溶液的抑制率最小(b)。由此可知，環(huán)糊精存在的條件下，脂肪氧合酶催化氧化亞油酸的反應(yīng)受到抑制的原因，除了環(huán)糊精包合底物亞油酸之外，環(huán)糊精還能與脂肪氧合酶直接發(fā)生相互作用，并且與環(huán)糊精包合底物抑制催化反應(yīng)相比，環(huán)糊精與脂肪氧合酶發(fā)生作用從而抑制反應(yīng)的程度更大，占主導(dǎo)地位。

圖1 β－CD的不同添加順序?qū)χ狙鹾厦傅淖饔肍ig.1 Comparison of inhibition effects of different β－cyclodextrins on the catalytic oxidation of linoleic acid by lipoxygenase in three different adding arrangements

2.2 環(huán)糊精抑制脂肪氧合酶活性的單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 反應(yīng)體系溫度對環(huán)糊精抑制效果的影響 從圖2中可以看出，隨著溫度升高，環(huán)糊精抑制脂肪氧合酶催化亞油酸氧化的作用增強(qiáng)，升到40℃時，氫過氧化物的含量開始明顯減少。原因可能是溫度升高使酶分子結(jié)構(gòu)變得松散，氨基酸殘基的暴露程度增大，有利于環(huán)糊精空腔與更多的疏水性氨基酸殘基發(fā)生復(fù)合作用，從而抑制了脂肪氧合酶的活性。

圖2 溫度對環(huán)糊精抑制脂肪氧合酶氧化活性的影響Fig.2 Effect of temperature on the inhibition of lipoxygenase by β－cyclodextrins

2.2.2 pH對環(huán)糊精抑制效果的影響 由圖3可以看出，隨著pH的升高，環(huán)糊精對脂肪氧合酶的抑制作用呈先減弱后增強(qiáng)的趨勢，當(dāng)pH9時，環(huán)糊精對脂肪氧合酶的抑制作用最弱。這可能是因?yàn)橹狙鹾厦傅拇呋磻?yīng)塑料最大時pH為9～10，隨著pH的變化，酶分子活性中心基團(tuán)解離程度發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致酶分子的活性構(gòu)象發(fā)生變化［9］，該變化將影響環(huán)糊精與脂肪氧合酶的結(jié)合程度。

圖3 pH對環(huán)糊精抑制脂肪氧合酶氧化活性的影響Fig.3 Effect of pH on the inhibition of lipoxygenase by β－cyclodextrins

2.2.3 環(huán)糊精濃度對環(huán)糊精抑制效果的影響 由圖4可以看出，隨環(huán)糊精濃度的減少，環(huán)糊精對脂肪氧合酶催化氧化活性的抑制作用也在減弱，這可能是因?yàn)榈蜐舛葧r，β－CD與脂肪氧合酶分子的相互作用較弱不致于引起酶分子的活性構(gòu)象的變化;隨著β－CD濃度的增加，能夠與脂肪氧合酶分子相互作用的疏水性空腔不斷增加，使得兩者的相互作用增強(qiáng)，改變了酶分子的活性構(gòu)象，從而抑制了酶的催化活性。

2.2.4 Fe3+和 Fe2+濃度對環(huán)糊精抑制效果的影響 在脂肪氧合酶中，鐵以兩種形態(tài)存在:Fe3+和Fe2+，其中 Fe3+是活化態(tài)，F(xiàn)e2+是非活化態(tài)，F(xiàn)e2+只有轉(zhuǎn)變成Fe3+才具有催化活性。

Fe3+濃度和Fe2+濃度對環(huán)糊精抑制作用的影響結(jié)果如圖5所示。

由圖5可以看出同濃度下，F(xiàn)e2+的抑制作用優(yōu)于Fe3+，這可能是因?yàn)檫m量的外源Fe3+通過電子傳遞促進(jìn)了脂肪氧合酶催化中心Fe2+向Fe3+的轉(zhuǎn)化，促進(jìn)酶促反應(yīng)進(jìn)行［10］。

2.3 各因素對環(huán)糊精抑制效果影響的正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)表1所設(shè)的因素水平表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表2所示，結(jié)果分析如表3所示。

圖4 環(huán)糊精濃度對環(huán)糊精抑制脂肪氧合酶氧化活性的影響Fig.4 Effect of decreasing concentrations of β－CD on the inhibition of lipoxygenase by β－cyclodextrins

圖5 Fe3+和Fe2+對環(huán)糊精抑制脂肪氧合酶氧化活性的影響Fig.5 Effects of decreasing concentrations of Fe3+and Fe2+on the inhibition of lipoxygenase by β－cyclodextrins

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of five factors and three levels orthogonal experiments

方差分析結(jié)果表明，因素C高度顯著，因素B顯著，因素D、E、A不顯著。環(huán)糊精濃度為10mmol/L，反應(yīng)溫度在35℃，反應(yīng) pH 為 4，F(xiàn)e3+濃度0.005μmol/L，F(xiàn)e2+濃度0.01μmol/L時，環(huán)糊精抑制脂肪氧合酶活性能力最高，在該實(shí)驗(yàn)條件下測定到的吸光值為0.118，經(jīng)計(jì)算環(huán)糊精對脂肪氧合酶的抑制率達(dá)到86.26% 。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

3 結(jié)論

環(huán)糊精能夠直接作用脂肪氧合酶從而抑制其活性;在環(huán)糊精濃度為10mmol/L，反應(yīng)溫度在35℃，反應(yīng) pH 為 4，F(xiàn)e3+濃度在 0.005μmol/L，F(xiàn)e2+濃度在0.01μmol/L時，環(huán)糊精抑制脂肪氧合酶活性能力最佳，抑制率達(dá)到86.26%。

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