呂肖楠，田 然，姜瞻梅，鄭冬梅，韓佳彤，田 波

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室，食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030)

大腸菌群是指一群在37℃、24h能夠發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌［1］，廣泛存在于人類和動物的腸道中，并且隨糞便廣泛分布。作為評價食品衛(wèi)生質(zhì)量指標(biāo)的重要標(biāo)準(zhǔn)之一，大腸菌群具有重要的衛(wèi)生學(xué)意義［2］。目前，針對大腸菌群的檢測，國家標(biāo)準(zhǔn)方法［3］和國外檢測方法［4］中常使用的初發(fā)酵培養(yǎng)基為 LST培養(yǎng)基。但是，使用初發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵常具有遲緩性、準(zhǔn)確性低等缺點。因此，發(fā)展一種快速、準(zhǔn)確的大腸菌群發(fā)酵培養(yǎng)基是十分必要的。本文在標(biāo)準(zhǔn)LST培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，對培養(yǎng)基中碳源和氮源不同配比對大腸菌群生長速率的影響作用進(jìn)行研究，利用Box－Behnken響應(yīng)曲面法優(yōu)化培養(yǎng)基［5－7］，旨在提高大腸菌群的發(fā)酵速率，為近一步研究快速檢測大腸菌群的方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌(Escherichia coli)由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院微生物實驗室選育、保藏;營養(yǎng)肉湯:蛋白胨10g/L，牛肉粉3g/L，氯化鈉5g/L，pH7.2;營養(yǎng)瓊脂:蛋白胨10g/L，牛肉粉3g/L，氯化鈉5g/L，瓊脂15g/L，pH7.2～7.4;LST 培養(yǎng)基:胰蛋白胨 20g/L，氯化鈉5g/L，乳糖5g/L，磷酸氫二鉀2.75g/L，磷酸氫二鉀2.75g/L，月桂基硫酸鈉 0.1g/L，pH6.8～7.0;胰蛋白胨、牛肉粉、酵母粉 生物純，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;瓊脂粉 生物純，日本Solaribio公司;乳糖分析純，天津市東方衛(wèi)生材料廠;氯化鈉、氫氧化鈉 分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司。

AL204/01型電子天平 梅特勒－托利多(上海)有限公司;HVE－50高溫高壓滅菌鍋、BHC－1100ⅡA2生物安全柜 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;HPS－160生化培養(yǎng)箱 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;PB－10 pH測定儀 廣州浩賽電子儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化 將大腸桿菌母種在無菌條件下接種到營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h后，放入4℃冰箱待用。

1.2.2 菌懸液制備 挑取斜面保藏的菌種2～3環(huán)接種于9mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24h后，放入4℃冰箱中待用。

1.2.3 培養(yǎng)基優(yōu)化方法

1.2.3.1 乳糖濃度的確定 以LST培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，保持其它組分不變，向其中添加不同濃度的乳糖，37℃培養(yǎng)24h，以大腸菌群菌落總數(shù)為指標(biāo)，計數(shù)方法參照 GB 4789.2－2010［8］，確定乳糖最適添加量。

1.2.3.2 胰蛋白胨濃度的確定 以LST培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，保持其它組分不變，分別向培養(yǎng)基中添加不同濃度的胰蛋白胨，37℃培養(yǎng)24h，以大腸菌群菌落總數(shù)為指標(biāo)，計數(shù)方法參照 GB 4789.2－2010［8］，確定胰蛋白胨最適添加量。

1.2.3.3 酵母粉濃度的確定 以LST培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，保持其它組分不變，分別向培養(yǎng)基中添加不同濃度的胰蛋白胨，37℃培養(yǎng)24h，以大腸菌群菌落總數(shù)為指標(biāo)，計數(shù)方法參照 GB 4789.2－2010［8］，確定酵母粉最適添加量。

1.2.3.4 響應(yīng)面分析實驗 依據(jù)單因素實驗的結(jié)果，以乳糖、胰蛋白胨和酵母粉濃度為自變量A、B、C，以其最佳濃度為自變量中心點值，設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面分析實驗，見表1。

表1 Box－Behnken實驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box－Behnken design

2 結(jié)果與討論

2.1 乳糖濃度優(yōu)化

選取乳糖作為培養(yǎng)基的碳源，考察了不同濃度的乳糖對大腸菌群發(fā)酵速率的影響。以37℃，培養(yǎng)24h后的菌落總數(shù)作為評價指標(biāo)，結(jié)果見圖1。

圖1 不同乳糖濃度對大腸菌群菌落總數(shù)的影響Fig.1 Influence of different concentration of lactose on the TVCs of coliform group

由圖1可知，乳糖濃度較小時菌落數(shù)較少，濃度較高時會抑制菌體的生長。當(dāng)乳糖濃度為0.5g/100mL時，菌落總數(shù)達(dá)到最優(yōu)值4.7×106cfu/mL。在發(fā)酵的過程中，乳糖具有雙效的作用，既作為碳源為菌體的生長提供營養(yǎng)物質(zhì)，同時又作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)大腸菌群產(chǎn)生β－半乳糖苷酶分解乳糖。乳糖濃度較低時，無法滿足菌體生長的需要，使其生長發(fā)育受到影響，同時，無法誘導(dǎo)大腸菌群產(chǎn)生β－半乳糖苷酶。隨著乳糖濃度的增加，培養(yǎng)基的滲透壓不斷增加反而會抑制菌體的生長和β－半乳糖苷酶的表達(dá)。因此，選取乳糖濃度為0.5g/100mL較為合適。在此濃度時，既能保證菌體的正常生長，又能起到高效的誘導(dǎo)作用。

2.2 胰蛋白胨濃度優(yōu)化

保持LST培養(yǎng)基中的其它成分不變，向其中添加不同濃度的胰蛋白胨，37℃培養(yǎng)24h后進(jìn)行菌落計數(shù)，得到較優(yōu)的胰蛋白胨濃度，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同胰蛋白胨濃度對大腸菌群菌落總數(shù)的影響Fig.2 Influence of different concentration of tryptone on the TVCs of coliform group

由圖2可以看出，胰蛋白胨的濃度對大腸菌群菌體生長有重要作用。隨著胰蛋白胨添加量的增加，大腸菌群菌落總數(shù)有明顯的提高，但添加量達(dá)到1.5g/100mL后繼續(xù)增加其濃度，菌落數(shù)呈現(xiàn)出下降趨勢。在大腸菌群生長的過程中，胰蛋白胨作為氮源的同時也可提供碳源，為大腸菌群提供必需的生長元素和生長因子，但添加濃度過高會抑制大腸菌群的生長，因此選取較優(yōu)的胰蛋白胨濃度為1.5g/100mL。

2.3 酵母粉濃度優(yōu)化

保持LST培養(yǎng)基中的其它成分不變，向其中添加不同濃度的酵母粉，37℃培養(yǎng)24h后進(jìn)行菌落計數(shù)，得到較優(yōu)的酵母粉濃度，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同酵母粉濃度對大腸菌群菌落總數(shù)的影響Fig.3 Influence of different concentration of yeast powder on the TVCs of coliform group

由圖3可知，隨著酵母粉濃度的提高，菌落總數(shù)呈現(xiàn)出逐漸上升趨勢，而當(dāng)酵母粉濃度超過0.3g/100mL時，菌落總數(shù)隨著酵母粉濃度的增加而呈現(xiàn)出下降趨勢。酵母粉富含蛋白質(zhì)、氨基酸、B族維生素和生長因子等物質(zhì)，能夠為微生物的生長補(bǔ)充氮源和各種維生素及生長因子［9］。較低濃度的酵母粉對大腸菌群的生長并沒有明顯的促進(jìn)作用，隨著濃度的增加，酵母粉對大腸菌群的生長促進(jìn)作用逐漸加強(qiáng)。繼續(xù)增加酵母粉的添加量，由于培養(yǎng)基中滲透壓增加以及溶氧能力減弱，大腸菌群的生長受到抑制。因此，選取酵母粉的最佳濃度為0.3g/100mL。

2.4 響應(yīng)曲面實驗設(shè)計優(yōu)化結(jié)果

2.4.1 模型的建立與分析 依據(jù)方法1.2.3.2進(jìn)行Box－Behnken實驗，實驗設(shè)計與結(jié)果見表2。

表2 Box－Behnken實驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Results of response surface experiments

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis results of regression and variance

利用Design Export軟件［10］對表1中的大腸菌群菌落總數(shù)進(jìn)行回歸分析與回歸擬合，得到響應(yīng)值Y與變量A、B、C之間的回歸方程為Y=10.2－0.062A+0.21B－0.13C－0.1AB－0.075AC－0.075BC－0.53A2－0.43B2－0.3C2?；貧w方程方差分析結(jié)果見表3。

據(jù)表3可知，模型方程中的常量p＜0.0001，表明此模型顯著［11］。模型的失擬項p=0.9136，說明失擬不顯著，回歸模型適合［12］。模型的相關(guān)系數(shù) R2=0.9929，表明模型與實際情況的擬合度較好。A、B、C三個因素的一次項、二次項以及AB、AC、BC的交互作用對菌落總數(shù)都有顯著影響，其中因素B、C以及AB、AC、BC的交互作用對菌落總數(shù)有極顯著影響。

2.4.2 響應(yīng)面的優(yōu)化與分析 根據(jù)回歸方程所作的響應(yīng)曲面圖如圖4～圖6所示。

圖4 乳糖濃度和胰蛋白胨濃度對大腸菌群細(xì)菌總數(shù)的響應(yīng)曲面圖Fig.4 Response surface of concentration of lactose and tryptone on the TVCs of coliform group

由圖4可知，乳糖、胰蛋白胨和酵母粉的濃度對大腸菌落菌落數(shù)都有較大的影響。乳糖、胰蛋白胨和酵母粉任意兩者之間的交互作用都顯著。在培養(yǎng)基中其它成分不變的條件下，隨著三者濃度的不斷升高，大腸菌群菌落總數(shù)皆呈現(xiàn)出先增大后逐漸減小的趨勢。由此說明大腸菌群生長需要適宜的碳氮比，過高或過低濃度的碳源或氮源都會影響大腸菌群的生長。在適宜的濃度條件下，大腸菌群能夠達(dá)到最佳的生長狀態(tài)。使用Design－expert 7.0軟件分析對回歸方程求解得到A=0.5，B=1.64，C=0.29，此時Y值預(yù)測為1.025×107cfu/mL。由此，可以初步確定較適宜的培養(yǎng)基組成為乳糖0.5g/100mL，胰蛋白胨1.64g/100mL，酵母粉0.29g/100mL。在此條件下，大腸菌群菌落總數(shù)達(dá)到最佳值為1.025×107cfu/mL。

圖5 乳糖濃度和酵母粉濃度對大腸菌群細(xì)菌總數(shù)的響應(yīng)曲面圖Fig.5 Response surface of concentration of lactose and yeast powder on the TVCs of coliform group

圖6 胰蛋白胨濃度和酵母粉濃度對大腸菌群細(xì)菌總數(shù)的響應(yīng)曲面圖Fig.6 Response surface of concentration of tryptone and yeast powder on the TVCs of coliform group

2.4.3 模型驗證實驗 在此優(yōu)化條件下進(jìn)行3次驗證性實驗，得到的大腸菌群實際菌落總數(shù)結(jié)果見表4，可知平均值為1.033×107cfu/mL，該值與理論預(yù)測值相差0.84%，說明通過響應(yīng)曲面法優(yōu)化得到的參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有可行性。

表4 模型驗證實驗結(jié)果Table 4 Results of model validation test

3 結(jié)論

本實驗在單因素實驗的基礎(chǔ)上，對大腸菌群初發(fā)酵培養(yǎng)基成分進(jìn)行了優(yōu)化，通過Box－Behnken響應(yīng)曲面法對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化，得到影響大腸菌群菌落總數(shù)的二次多項式回歸模型。最終得到的優(yōu)化培養(yǎng)基組成為:乳糖0.5g/100mL，胰蛋白胨1.64g/100mL，酵母粉0.29g/100mL，在此條件下可以得到大腸菌群菌落總數(shù)的最佳值1.025×107cfu/mL，對實驗結(jié)果進(jìn)行驗證，得到的實際值為1.033×107cfu/mL，與理論預(yù)測值基本一致。本實驗為進(jìn)一步研究大腸菌群快速檢測方法奠定了基礎(chǔ)。

［1］劉慧.現(xiàn)代食品微生物學(xué)［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，2006.

［2］杜連祥，路福平.微生物學(xué)實驗技術(shù)［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，2008.

［3］中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 4789.3－2010，食品微生物學(xué)檢驗 大腸菌群計數(shù)［S］.北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

［4］MA Yanez，C Valor，V Catalan.A simple and cost－ effective method for the quantification of total coliforms and Escherichia coli in potable water［J］.Journal of Microbiological Mehods，2006，65:608－611.

［5］劉曉永，王強(qiáng)，劉紅芝.基于二次正交旋轉(zhuǎn)回歸實驗的酵母β－葡聚糖發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化［J］.釀酒科技，2007(4):32－36.

［6］葛珍珍，王杰，周燦燦.響應(yīng)面法優(yōu)化小球藻培養(yǎng)基［J］.食品工業(yè)科技，2012，33(16):196－198.

［7］潘自皓，顧薇響.響應(yīng)面法優(yōu)化大腸桿菌X－12發(fā)酵培養(yǎng)基的研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科技，2009，37(36):17982－17985.

［8］中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 4789.2－2010，食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定［s］.北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

［9］陳燦映.大腸菌群快速檢測培養(yǎng)基的研制及評價［D］.鄭州:鄭州大學(xué)，2012.

［10］衣丹，劉發(fā)義，臧家業(yè).響應(yīng)面法優(yōu)化堿蓬葉蛋白提取工藝研究［J］.食品工業(yè)，2011(10):52－54.

［11］BVV Ratnam， M Narasimha Rao， M Dmodar Rao.Optimization of fermentation conditions for the production of ethanol from sago starch using response surface methodology［J］.World Journal of Microbiology ＆ Biotechnology，2003，19:523－526.

［12］Joglekar AM，May AT.Product excellence through design of experiment［J］.Cereal Foods World，1987(32):857－868.