張 紅，胡青平

(山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西臨汾041004)

饅頭是我們北方日常生活中常見(jiàn)的一種主食。傳統(tǒng)的制作方法是在面粉中加入一定量的水和酸面團(tuán)然后和成面團(tuán)，再經(jīng)過(guò)發(fā)酵，揉制，成型，醒發(fā)，最后通過(guò)汽蒸熟化定形而成的一種面制食品［1］。酸面團(tuán)是由谷物、水、發(fā)酵微生物經(jīng)過(guò)發(fā)酵制成的一種面制品，它在發(fā)酵面食中起著非常重要的作用。它不僅可以改善面團(tuán)的質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味、口感等，而且可以防止因真菌和細(xì)菌引起的腐?。?］。隨著社會(huì)的進(jìn)步，人們對(duì)饅頭的質(zhì)量也提出了更高的要求，替代品的作用效果遠(yuǎn)不及傳統(tǒng)的酸面團(tuán)，不能滿足人們的需要，因此酸面團(tuán)再度受到極大的關(guān)注［3］。目前，國(guó)外學(xué)者已分離、篩選出了酸面團(tuán)中具有代表性的菌種，并研究了其特性，且研制出了一系列的產(chǎn)品來(lái)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的酸面團(tuán)［2］。而我國(guó)對(duì)于酸面團(tuán)的研究還主要集中在風(fēng)味物質(zhì)及其發(fā)酵微生物的分離純化等方面，如胡麗花等［3］論述了多菌種混合發(fā)酵可提高有機(jī)酸、醇類、酯類等風(fēng)味物質(zhì);丁長(zhǎng)河等［4］通過(guò)對(duì)饅頭的咀嚼性，膠性，凝聚性，硬度等方面對(duì)老酵頭發(fā)酵的饅頭品質(zhì)與工廠化生產(chǎn)進(jìn)行了比較，證明了使用老酵頭制作的饅頭品質(zhì)優(yōu)于工廠化生產(chǎn)的饅頭;張慶等［5］通過(guò)對(duì)4類面包的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行研究，考察了植物乳桿菌燕麥酸面團(tuán)發(fā)酵劑及其凍干工藝對(duì)面包風(fēng)味的影響;蘇東海［6］對(duì)酸面團(tuán)中的酵母進(jìn)行了分離純化等。但是對(duì)于酸面團(tuán)中發(fā)酵微生物的來(lái)源及其對(duì)面團(tuán)發(fā)酵速度的影響等方面還鮮有報(bào)導(dǎo)。本文主要探究發(fā)酵微生物的最初來(lái)源，并對(duì)分離到的酵母菌和乳酸菌做了發(fā)酵優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，為提高面團(tuán)發(fā)酵速度提供了理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

面粉選用中筋粉 購(gòu)于市內(nèi);PDA培養(yǎng)基［6］:馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂20g，水 1000mL;MRS 培養(yǎng)基［7］:蛋白胨 10g，牛肉膏 10g，酵母膏 5g，葡萄糖20g，吐溫 80 1.0mL，K2HPO42g，醋酸鈉 5g，檸檬酸二銨 2g，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·4 H2O 0.25g，蒸餾水1000mL，pH6.2～6.6。

722S可見(jiàn)光分光光度計(jì) 上海菁華科技有限公司;HC－TP－12型架盤天平 生產(chǎn)廠家或產(chǎn)地;85－2恒溫磁力攪拌器 國(guó)華;pHS－3C酸度計(jì) 金昌儀器;顯微鏡 OLYMPUS;YXQ－LS－SⅡ高壓蒸汽滅菌鍋 上海市博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;101－3BS電熱鼓風(fēng)干燥箱 金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 初探酸面團(tuán)中自然發(fā)酵微生物的最初來(lái)源經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)20min制備無(wú)菌面粉和無(wú)菌水適量備用。取面粉20.0g，水10.0mL揉捏至表面光滑且內(nèi)部均勻沒(méi)有硬塊為宜［7］，經(jīng)保鮮膜包裹，放入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，31℃培養(yǎng)箱中醒發(fā)48h，觀察酸面團(tuán)的感官指標(biāo)并測(cè)定酸面團(tuán)的pH。具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)按照表1所示。并從發(fā)酵后面團(tuán)體積、氣味、粘度、氣泡和pH出發(fā)設(shè)置了0～5分5個(gè)分值的感官評(píng)價(jià)表(見(jiàn)表2)來(lái)比較各實(shí)驗(yàn)組的發(fā)酵程度，分值越高發(fā)酵越明顯。

表1 初探酸面團(tuán)中自然發(fā)酵微生物最初來(lái)源的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 The experimental design of the original sources of natural fermentation microorganisms in sour dough

表2 面團(tuán)發(fā)酵情況評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 The scoring criteria of the dough fermentation conditions

1.2.2 自然發(fā)酵酸面團(tuán)中活性微生物的分離純化 稱取10.0g發(fā)酵面團(tuán)，放入盛有90mL無(wú)菌水的燒杯中，并用磁力攪拌器攪拌30min后靜止10min。分別取上清液0.2mL涂布于PDA培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基中31℃培養(yǎng)72h。對(duì)PDA培養(yǎng)基上的典型的酵母菌菌落進(jìn)行鏡檢，并采用平板劃線法繼續(xù)分離純化;對(duì)MRS培養(yǎng)基上的典型的乳酸菌菌落進(jìn)行鏡檢、革蘭氏染色、過(guò)氧化氫酶等實(shí)驗(yàn)，凡是革蘭氏陽(yáng)性菌、過(guò)氧化氫酶陰性的菌株，采用平板劃線法進(jìn)行分離純化。

1.2.3 酵母菌和乳酸菌的發(fā)酵酸面團(tuán) 制備酵母菌和乳酸菌菌液各100mL，并測(cè)得它們?cè)?00nm時(shí)的OD值分別為1.740、1.630。面團(tuán)的基本配方為面粉40g、菌液和水共20mL。

在面團(tuán)基本配方的基礎(chǔ)上，添加的酵母菌菌液∶乳酸菌菌液∶水的比例為 5∶0∶15、10∶0∶10、20∶0∶0、0∶5∶15、0∶10∶10、0∶20∶0、5∶15∶0、10∶10∶0、15∶5∶0、0∶0∶20。按上述方法和制的面團(tuán)并等分成三個(gè)小面團(tuán)，并揉捏成直徑為4.5cm的扁圓形，分別放入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，并用10mL的自來(lái)水將面團(tuán)表面浸濕。放入31℃的恒溫箱中醒發(fā)4h。

1.2.4 酸面團(tuán)中pH的測(cè)定 用潔凈的小刀分別切取各個(gè)實(shí)驗(yàn)組的發(fā)酵面團(tuán)3.0g，放入盛有30mL蒸餾水的小燒杯中，用玻璃棒將面團(tuán)攪碎后用磁力攪拌器攪拌10min使其充分?jǐn)噭?，靜置10min后用酸度計(jì)測(cè)定該混合液的 pH［7］。

1.2.5 酸面團(tuán)直徑的測(cè)定 將1.2.3中放置面團(tuán)的培養(yǎng)皿取出，用刻度尺測(cè)量面團(tuán)與培養(yǎng)皿上下皿蓋接觸面的直徑，分別記作D1、D2。

2 結(jié)果與討論

2.1 酸面團(tuán)中活性微生物的來(lái)源

根據(jù)酸面團(tuán)的制作工藝，推測(cè)酸面團(tuán)的自然發(fā)酵種可能來(lái)源于面粉、水或空氣中。為了探究其主要來(lái)源，設(shè)計(jì)了表1的實(shí)驗(yàn)，并通過(guò)表2賦予分值來(lái)比較實(shí)驗(yàn)組的發(fā)酵程度。具體結(jié)果見(jiàn)圖1、表3。

圖1 酸面團(tuán)的pH變化Fig.1 Changes of pH of sour dough

從圖1和表3可知實(shí)驗(yàn)組1發(fā)酵效果最為明顯。這是因?yàn)槊娣郾旧砗械矸勖笗?huì)將淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖，進(jìn)而可被酵母菌和乳酸菌等發(fā)酵微生物利用。而無(wú)菌面粉是面粉經(jīng)過(guò)高壓蒸氣滅菌后所得，其面粉中酶失活，不能將淀粉分解為葡萄糖，因此不能被酵母菌和乳酸菌利用。此外，空氣中含有紫外線，它具有強(qiáng)烈的殺菌作用，并且空氣中沒(méi)有微生物生長(zhǎng)繁殖所必需的營(yíng)養(yǎng)物、充足的水分以及其他條件。因此，它不適宜微生物的生存。水中沒(méi)有供酵母菌和乳酸菌利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此含量也很少。由圖1可知實(shí)驗(yàn)2、3、4的pH下降也很明顯，這是因?yàn)楸ｕr膜上附著著一些霉腐微生物，這些微生物會(huì)利用面粉中的淀粉產(chǎn)酸。由圖1和表3可知，酸面團(tuán)中的發(fā)酵微生物主要來(lái)自面粉當(dāng)中，其次是空氣和水當(dāng)中。

表3 48h后面團(tuán)的變化情況Table 3 Changes of sour dough after 48h

2.2 酸面團(tuán)中活性微生物的分離純化及初步鑒定

將分離到的酵母菌和乳酸菌分別標(biāo)記為Yzh和Rzh。

通過(guò)圖2可看出Yzh的菌落大而突起，呈乳白色，直徑為1.2～2.5mm;菌落與培養(yǎng)基間的連接不緊密，容易挑起;菌落正反顏色、構(gòu)造，以及邊緣與中心的顏色、構(gòu)造一致。圖4為Yzh在高倍鏡下的細(xì)胞形態(tài)，可觀察到它是一種卵圓形的單細(xì)胞微生物，繁殖方式有出芽生殖。

通過(guò)圖3可看出Rzh的菌落較小，且有小突起;菌落與培養(yǎng)基間的連接不緊密，容易挑起;菌落正反顏色、構(gòu)造，以及邊緣與中心的顏色、構(gòu)造一致。經(jīng)驗(yàn)證Rzh為無(wú)鞭毛的過(guò)氧化氫陰性菌。圖5為Rzh經(jīng)過(guò)革蘭氏染色后在油鏡下的形態(tài)，可得出它是一種短桿狀的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。通過(guò)查閱文獻(xiàn)［8－12］可知，酸面團(tuán)中分離到的酵母菌主要是酵母菌屬和假絲酵母屬，乳酸菌絕大多數(shù)是乳桿菌。

圖2 酵母菌群落Fig.2 Yeast community

2.3 酵母菌和乳酸菌發(fā)酵面團(tuán)的實(shí)驗(yàn)

圖3 乳酸菌群落Fig.3 Lactic acid bacteria community

圖4 酵母菌的個(gè)體形態(tài)Fig.4 The individual characteristic of yeast

圖5 乳酸菌的革蘭氏染色Fig.5 The Gram stain of lactic acid bacteria

由圖 6 可知，菌液比為 5∶0∶15、10∶0∶10、20∶0∶0、5∶15∶0、10∶10∶0、15∶5∶0 的實(shí)驗(yàn)組體積增大明顯，其中20∶0∶0的實(shí)驗(yàn)組體積增大的幅度最大;由圖7可知，菌液比為 0∶5∶15、0∶10∶10、0∶20∶0、5∶15∶0、10∶10∶0、15∶5∶0的實(shí)驗(yàn)組 pH 相對(duì)較低，其中 10∶10∶0 的 pH 最低。綜合考慮，菌液比為 5∶15∶0、10∶10∶0、15∶5∶0 的實(shí)驗(yàn)組發(fā)酵效果最好。為了探究發(fā)酵最優(yōu)組的菌液比，分別對(duì)體積增大明顯的實(shí)驗(yàn)組和pH相對(duì)較低組做了統(tǒng)計(jì)分析見(jiàn)表4、表5。因20∶0∶0的實(shí)驗(yàn)組體積增大的幅度最大，所以能達(dá)到該體積的菌液比及為最佳比例，又由表3 可看出，菌液比為 10∶10∶0、15∶5∶0 的實(shí)驗(yàn)組與20∶0∶0的實(shí)驗(yàn)組之間沒(méi)有顯著性差異。因此，10∶10∶0 為最優(yōu)發(fā)酵菌液比。

圖6 4h后不同菌液比例下面團(tuán)直徑變化Fig.6 Changes of group product in different bacteria liquit ration after 4h

圖7 4h后不同菌液比例下面團(tuán)pH的變化Fig.7 Changes of group product in different bacteria liquid ratio after 4h

表4 4h后面團(tuán)直徑D2均值差分析Table 4 Analysis means difference of dough diameter D2 after 4h

表5 4h后面團(tuán)pH均值差分析Table 5 Analysis means difference of dough pH after 4h

在面團(tuán)發(fā)酵期間，面粉中的淀粉酶將分解淀粉生成葡萄糖，而后酵母菌分解利用葡萄糖產(chǎn)生乙醇和CO2，生成的CO2一部分以氣體狀態(tài)存在與面團(tuán)內(nèi)，另一部分溶于液相的水中變成碳酸。碳酸是一種不穩(wěn)定的弱酸對(duì)面團(tuán)的pH影響很?。?3］。因此添加酵母菌對(duì)體積增大有顯著地作用，但對(duì)pH下降并沒(méi)有太大的影響。對(duì)于面團(tuán)pH下降的主要原因是乳酸菌利用面團(tuán)中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸。乳酸是一種較強(qiáng)的有機(jī)酸，且發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的也較多［13］，所以單一添加乳酸菌和添加混菌的面團(tuán)，發(fā)酵4h后面團(tuán)的pH明顯減小。傳統(tǒng)的酸面團(tuán)除了含有酵母菌和乳酸菌外還含有其他種類的微生物群，它們?cè)诎l(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生少量的風(fēng)味物質(zhì)，如酯類，醛、酮類等［2］。傳統(tǒng)的酸面團(tuán)制作的饅頭雖然好吃，但是民間發(fā)酵不是一個(gè)穩(wěn)定的產(chǎn)品，衛(wèi)生狀況也令人擔(dān)憂，因此盡快地實(shí)現(xiàn)其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)是十分必要的［2］。

3 結(jié)論

本文主要通過(guò)五個(gè)實(shí)驗(yàn)組對(duì)酸面團(tuán)中發(fā)酵微生物的來(lái)源進(jìn)行探究，并對(duì)分離到的酵母菌Yzh和乳酸菌Rzh進(jìn)行了發(fā)酵優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如下:面團(tuán)中的發(fā)酵微生物主要來(lái)自于面粉當(dāng)中，其次是空氣和水當(dāng)中。使用不同比例的Yzh菌液(OD600=1.740)和Rzh菌液(OD600=1.630)發(fā)酵面團(tuán)4h后，Yzh∶Rzh為10∶10時(shí)面團(tuán)發(fā)酵的效果最好。

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